La technique d’amélioration de la relaxation paramagnétique peut être utilisée pour caractériser et mesurer les distances intermoléculaires et quantifier les interactions biomoléculaires transitoires et / ou faiblement peuplées. Ici, nous avons appliqué cette technique pour capturer les interactions qui précèdent la condensation des protéines. La sensibilité des PRE permet l’identification, la détection et la quantification de la résolution atomique de l’état dynamique qui restent invisibles et inaccessibles aux autres techniques de RMN.
Les étapes clés de ce protocole comprennent le retrait de l’étiquette de spin du nitroxide non conjugué et l’analyse minutieuse des spectres pour mesurer avec précision la hauteur du pic. De plus, il faut faire preuve de prudence lors de la configuration de l’expérience RMN et de l’étalonnage des impulsions. Pour commencer, ajoutez le 3-maleimido-PROXYL à partir d’une solution mère à 20 fois l’excès molaire de la protéine 15N marquée isotopiquement d’intérêt.
Incuber pendant la nuit à température ambiante ou à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière et de l’oxygène et avec un léger balancement ou nutation. Le lendemain, retirez l’étiquette de rotation libre sans réaction pour empêcher l’ERP de solvant non spécifique en utilisant soit une dialyse extensive de l’échantillon de protéines, soit en utilisant la filtration sur gel. Utilisez ensuite le réactif d’Ellman pour quantifier les groupes sulfhydryles libres dans la solution.
Mesurez l’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques et construisez la courbe standard. Pour mesurer le PRE intramoléculaire, préparer une protéine de spin marquée au 15N enrichie isotopiquement à une concentration d’au moins 100 micromolaires, mais pas plus de 300 micromolaires, dans un tampon adapté à la RMN. Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre à longue tige ou d’une micropipette, transférer l’échantillon RMN dans un tube RMN de cinq millimètres approprié pour une utilisation dans des aimants à champ élevé.
Placez l’échantillon dans l’aimant. Verrouillez le signal de deutérium à l’aide de la commande de verrouillage et réglez et faites correspondre le canal protonique selon les protocoles de l’installation. Ajustez ensuite les cales à l’aide du sous-programme de cale supérieure pour optimiser la suppression du signal de solvant.
Ensuite, calibrez l’impulsion de protons à l’aide du programme P-OPT. Ensuite, étalonnez l’impulsion 15N par rapport à un échantillon standard. Déterminez l’atténuation correcte pour les impulsions façonnées à l’aide de la sous-routine de l’outil de forme.
Ouvrez ensuite le fichier de forme d’impulsion approprié en cliquant sur l’icône de dossier. Les impulsions façonnées se trouvent dans la section des paramètres d’impulsion des paramètres d’acquisition. Après avoir chargé le fichier de définition d’impulsion, cliquez sur Analyser la forme d’onde, puis sur Intégrer la forme.
Entrez l’impulsion dure de 90 degrés du proton étalonné, la longueur d’impulsion de forme souhaitée et la rotation. Calculez ensuite le niveau de puissance de l’impulsion façonnée en ajoutant le changement de niveau de puissance à l’atténuation pour l’impulsion calibrée de 90 degrés. Enregistrez un HSQC proton 15N standard pour optimiser la largeur de balayage, la fréquence porteuse et vérifier la suppression de l’eau.
Enfin, réglez la largeur du balayage et le nombre d’incréments de cotes indirectes à l’aide des commandes SW et TD ou directement dans les boîtes de dialogue appropriées. Calibrer les impulsions façonnées comme démontré précédemment. Entrez ensuite les longueurs d’impulsion calibrées dans la section Paramètres d’impulsion de l’onglet Paramètres d’acquisition.
Pour mesurer le proton amide T2 en utilisant l’approche à deux points de retard, définissez les délais en modifiant le fichier de liste VD. Le premier délai est défini sur 0,01 milliseconde. En utilisant la relation avec le PRE maximal attendu, choisissez le deuxième délai.
Ensuite, déterminez une valeur appropriée en comparant les premiers incréments des premier et deuxième spectres de retard et en ajustant le deuxième retard de telle sorte que le signal diminue entre 40 et 50% de sa valeur initiale. Déterminez le nombre de points complexes à enregistrer et le nombre de balayages pour une moyenne de signal suffisante. Utilisez ensuite la commande EXPT pour calculer la durée de l’expérience et démarrez l’expérience avec la commande ZG. Après avoir dissous l’ascorbate de sodium dans le tampon RMN, ajuster le pH pour qu’il corresponde à celui du tampon RMN d’origine.
Ajoutez ensuite l’acide ascorbique dans le tube RMN à un excès molaire 10 fois supérieur à la concentration de l’étiquette de spin en plaçant une gouttelette sous le bord du tube. Boucher le tube et retourner soigneusement pour mélanger. Faire tourner à 200 à 400 g pendant 10 à 20 secondes dans une centrifugeuse à manivelle pour déposer l’échantillon au fond du tube.
Après avoir enveloppé le tube dans du papier d’aluminium, laissez la réaction se dérouler pendant au moins trois heures. Enregistrez ensuite le proton amide T2 sur l’échantillon diamagnétique en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour l’échantillon paramagnétique. Les PREs gammas intramoléculaires amide protonique ont été enregistrés sur un fragment intrinsèquement désordonné auto-associatif dérivé du domaine de faible complexité de la protéine de liaison à l’ARN EWSR1.
Les résidus à proximité séquentielle étroite du point de fixation de l’étiquette de spin devraient être considérablement élargis et ne sont pas détectables dans le spectre. Les résidus qui étaient espacés séquentiellement à partir du point d’attache mais qui présentaient un gamma amélioré étaient spatialement proches de l’étiquette de spin. Dans le cas des protéines intrinsèquement désordonnées, l’enregistrement et l’analyse des purées fourniront des informations sur les contacts intramoléculaires et les surfaces d’interaction transitoires.
La combinaison des mesures PRE avec d’autres méthodes biophysiques telles que la diffusion dynamique de la lumière, la chromatographie d’exclusion de taille, l’ultracentrifugation analytique et les méthodes informatiques peut fournir des informations plus approfondies. La mesure PRE aide à caractériser l’état transitoire peu peuplé. Cette approche pourrait être élargie pour caractériser les interactions importantes pour une myriade de processus biologiques tels que la reconnaissance moléculaire, la sélection conformationnelle allostérique et les processus d’assemblage, y compris l’assemblage d’organites sans membrane par séparation de phase.
