פרוטוקול זה משתמש באוטומציה כדי לבצע תכשירים לביוכימיה של חלבונים לפני ניסויי ספקטרומטריית מסה, המאפשרים תפוקה גבוהה יותר ושונות נמוכה יותר למחקרים פרוטאומיים. פרוטוקול זה משתמש במערכת טיפול בנוזלים זולה הניתנת לתכנות הניתנת לתכנות, הניתנת במחיר סביר למעבדות נוספות. אנו מספקים סקריפטים קוד פתוח של פייתון שניתן לשנות לפיתוח נוסף.
מי שמדגים את ההליך יהיה מילטון אמאיה, סטודנט לתואר שני במעבדה שלנו. כדי להתחיל, פתח את noSP3_Digestion. קובץ Script py בעורך הטקסט וציין את המשתנים הספציפיים לניסוי לפי הצורך בסעיף התאמה אישית כאן בלבד.
לאחר מכן, פתח את האפליקציה Opentrons והעלה את קובץ ה- Script לכרטיסיה פרוטוקול ביישום Opentrons. לאחר מכן, מקם את תוכנות המעבדה והפיפטות הנדרשות במיקום המתאים בחפיסת OT2 שצוינה בתסריט של פייתון. לאחר מכן, מניחים את תמיסת האמוניום ביקרבונט בבאר A1 של מתלה הצינורות 4 באחד עם מחזיק צינור 15 מיליליטר בתוספת 50 מיליליטר למעלה ומניחים את דגימת החלבון בבאר A1 של מתלה הצינור ארבעה באחד עם מחזיק צינור שני מיליליטר העליון.
הניחו באופן ידני צינורות בעלי 2 מיליליטר בצינורות של בלוק האלומיניום המונחים על גבי מודול הטמפרטורה, החל מ- A1 ונעים למטה אנכית. לאחר מכן, מקם את פתרון DTT בבאר A6 של מתלה הצינור ארבעה באחד עם מחזיק צינור שני מיליליטר העליון. שימו לב בזמן שהרובוט מעביר נפח מתאים של מאגר האמוניום ביקרבונט לצינורות הדגימה בבלוק האלומיניום.
לאחר מכן, ודא באופן ידני שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה, ודא ש- DTT נטען ל- A6 של ארון הצינורות של שני מיליליטר הממוקם בחריץ ארבע לפני חידוש הפרוטוקול. לאחר אישור המיקום של צינור DTT ופתיחת מכסה הצינור, לחץ על לחצן חדש באפליקציית Opentrons כדי להמשיך. ודא כי הרובוט מעביר 10 מיקרוליטרים של פתרון DTT לכל מדגם היטב, ואחריו חמישה סיבובי ערבוב.
לאחר מכן, ודא שתוכנית הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה, הקפד לסגור כובעים בצינורות מדגם. לאחר מכן, סגור באופן ידני את המכסים של הצינורות ולחץ על Resume כדי להמשיך. חכו עד שמודול הטמפרטורה של הרובוט יתחיל לחמם את בלוק האלומיניום והטמפרטורה תגיע ל-55 מעלות צלזיוס, ואחריה דגירה של חמש דקות כדי לאפשר לדגימות להגיע ל-55 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן הרובוט יחזיק את הטמפרטורה הזו במשך 30 דקות כדי לאפשר הפחתת חלבון על ידי DTT. במהלך הדגירה, להכין פתרון iodoacetamide ולעטוף אותו באופן ידני עם רדיד אלומיניום, כדי למנוע חשיפה לאור. לאחר הדגירה, כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את הודעת האזהרה, הקפד לפתוח כובעים על צינורות מדגם, לפתוח את צינורות המדגם ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך.
לאחר מכן, ודא באופן ידני כי התוכנית של הרובוט מושהה עם הודעת האזהרה, ודא iodoacetamide נטען לתוך B6 של מתלה צינור שני מיליליטר הממוקם בחריץ ארבע לפני חידוש הפרוטוקול. לאחר אישור מיקום המדף של צינור iodoacetamide ופתיחת מכסה הצינור, לחץ על קורות חיים וודא כי הרובוט מעביר 10 מיקרוליטרים של פתרון iodoacetamide לכל צינור מדגם, ואחריו חמישה סיבובי ערבוב. כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה, סגור כובעים על צינורות מדגם, לכסות את צינורות המדגם ולכסות אותם בנייר כסף, ולאחר מכן לכסות את בלוק האלומיניום כולו עם חתיכת נייר אלומיניום נקי ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך.
המתינו עד שהדגימות ידגרו ב-22 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, וודאו שמודול הטמפרטורה של הרובוט מתפרק עם השלמת הדגירה של האיאודו-אצטטמיד. כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את הודעת האזהרה, ודא טריפסין נטען לתוך C6 של ארון צינור שני מיליליטר הממוקם בחריץ ארבע לפני חידוש הפרוטוקול, למקם פתרון טריפסין בבאר C6 של מתלה צינור שני מיליליטר עם מכסה הצינור פתוח, ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך. לאחר מכן, כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את הודעת האזהרה, פתח כובעים על צינורות מדגם במודול הטמפרטורה, בטל את צינורות הדגימה ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך.
המתנה בזמן שהרובוט מעביר 10 מיקרוליטרים של טריפסין לכל צינור דגימה, ואחריו חמישה סיבובי ערבוב. לאחר עיכול טריפסין בן לילה, לסובב בקצרה את הדגימות באמצעות microcentrifuge ספסל ומניחים את הדגימות על מתלה צינור מגנטי. לאחר שתי דקות, העבירו את הסופר-צינור בזהירות עם פיפטה לקבוצה חדשה של צינורות מיקרו-צנטריפוגה בעלי קיבולת נמוכה של חלבון, ושמרו את הדגימות במקרר.
לאחר מכן, פתח את SP3_peptide_cleanup. סקריפט py Python בעורך טקסט, וציין את משתני הניסוי לפי הצורך בסעיף התאמה אישית כאן בלבד. לאחר מכן, העלה את קובץ ה- Script לכרטיסיה פרוטוקול ביישום Opentrons.
מקם את תוכנות המעבדה והפיפטות הנדרשות במיקום המתאים בחפיסת OT2 שצוינה בתסריט פייתון, וודא שהמודול המגנטי מופעל ומחובר לרובוט. מניחים לוח באר חדש, שני מיליליטר, 96-well עמוק היטב על החלק העליון של המודול המגנטי. לאחר מכן, מקם את הדגימות המעוכלות בארון הצינורות של שני מיליליטר החל מ- A1 ותנועה למטה אנכית.
לאחר מכן, ודאו שהרובוט מעביר 55 מיקרוליטרים של הדגימות המעוכלות לבארות בלוחות הבאר העמוקים במודול המגנטי. ודא שפרוטוקול הרובוט מושהה ומציג את ההודעה, ודא שחרוזים מוכנים נטענו לתוך A6 של מתלה צינור שני מיליליטר הממוקם בחריץ ארבע לפני חידוש הפרוטוקול. לאחר מכן, מערבולת לזמן קצר לסובב את חרוזי SP3 בצנטריפוגה מיני ספסל ומניחים אותם בבאר A6 של מתלה צינור שני מיליליטר עם הכובע פתוח.
ודא שתוכנית הרובוטים מושהית ומציגה את ההודעה, ודא ש- 80% אתנול נטען ל- A4 של 15 מיליליטר בתוספת ארון אוורור של 50 מיליליטר הממוקם בחריץ חמש לפני חידוש הפרוטוקול. לאחר מכן, למקם פתרון 80% אתנול בבאר A4 בארון הצינור ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך. שימו לב בזמן שהרובוט משנה את מהירות הצנרת להאטה, שואף את הסופר-נרטיב מכל באר ומחלק אותו לצינור הפסולת.
המתן עד שהרובוט ישנה את מהירות הצנרת בחזרה לברירת המחדל וינתק את המודול המגנטי. כאשר תוכנית הרובוטים מושהית ומציגה את ההודעה, פתח את המכסה על צינור אמוניום ביקרבונט, פתח את המכסה של פתרון אמוניום ביקרבונט ולאחר מכן לחץ על קורות חיים כדי להמשיך. המתנה בזמן שהרובוט מנתק את המודול המגנטי, מעביר 250 מיקרוליטרים של חיץ האמוניום ביקרבונט לכל באר, ומיד מתערבב במשך 10 פעמים.
לאחר מכן, התבונן בזמן שהרובוט משנה את מהירות הצנרת להאטה, ומעביר את הסופר-נרטיב מכל באר לצינור הפסולת. המתינו עד שהרובוט יעביר 100 מיקרוליטרים של מאגר האמוניום ביקרבונט לכל באר ומיד יתערבבו 10 פעמים. ודא שתוכנית הרובוטים מושהית ומציגה את ההודעה, ודא שצינורות איסוף חדשים הוצבו בבלוק האלומיניום של שני מיליליטר לפני חידוש הפרוטוקול.
לאחר מכן, מקם קבוצה חדשה של צינורות מיקרו-צנטריפוגה עם שימור חלבון נמוך בבלוק האלומיניום מיד לאחר צינור הדגימה האחרון בתחילה בבלוק, ולחץ על חדש כדי להמשיך. המתנה בזמן שהרובוט מעביר כל דגימה במאגר האמוניום ביקרבונט לצינורות שני המיליליטר החדשים. כאשר התוכנית של הרובוט מושהית ומציגה את ההודעה, ודא טריפסין נטען לתוך C6 של מתלה צינור שני מיליליטר הממוקם בחריץ ארבע לפני חידוש הפרוטוקול, למקם את פתרון טריפסין בבאר C6 של מתלה צינור שני מיליליטר עם מכסה הצינור פתוח, ולחץ על קורות חיים כדי להמשיך.
לאחר שהתוכנית מסתיימת לרוץ, לעטוף את כובעי צינור מדגם עם סרט פרפין, להעביר את כל הדגימות למיקסר מבוקר טמפרטורה, ודגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 20 שעות עם 1, 000 סל"ד רועד. עם מדגם BSA, זוהה מדיום של 728 התאמות ספקטרום פפטיד ו 65 פפטידים זוהו, עם 5.2% ו 3.2% מקדמי וריאציה, בהתאמה. עם דגימת לב מורכבת, זוהה מדיום של 9, 526 התאמות בספקטרום פפטידים, 7, 558 פפטידים ו-1, 336 חלבונים ב-10 ריצות עם 7.6%5.9% ו-3.6% מקדמי וריאציה, בהתאמה.
כדי לקבוע את השונות בכימות פפטיד, מקדמי וריאציה של עוצמות כרומטוגרמה יון שחולצו חושבו עבור 10 פפטידים הממפים לחלבון ייחודי. כאשר השונות של תוצאות ניסוי אנושיות לעומת רובוטיות במדידת ריכוז החלבון הושוו עוד יותר לבדיקת BCA, המקדם הממוצע של וריאציה של בדיקת הרובוט BCA היה נמוך יותר מאשר בדיקת BCA הידנית האנושית. פרוטוקול זה מקטין את זמן הספסל לעיבוד כל דגימה.
זה סולל לנו את הדרך לחקור את ההבדלים בפרוטאומיקה בפאנל של קווי תאים בין טיפולים תרופתיים מרובים.
