שיטה זו מספקת פתרונות לשאלות הביולוגיות התובעניות של ימינו. מניסוי FPOP בתא, אנו יכולים לחקור אינטראקציות חלבון-ליגנד, אתרי אינטראקציה בין חלבונים לחלבון ואזורים של שינוי קונפורמי. היתרון של טכנולוגיה זו הוא השימוש בפלטפורמת IC-FPOP אוטומטית מבוססת שש בארות המאפשרת לגדל תאים ולבצע מחקרי FPOP בתאים ממש בלייזר.
שיטה זו יכולה לשמש בתעשיות התרופות והביוטכנולוגיה, כמו גם במכוני מחקר אקדמיים וקליניים גדולים, במיוחד על ידי חוקרים ביולוגיים באוניברסיטאות החוקרות דינמיקה של חלבונים. כדי להתחיל, פתח את חממת האסדה משלב המיקום ונתק את קווי הטמפרטורה, הגז ומכשיר האדים. מרססים את האינקובטור ב-70% אתנול ומניחים אותו במכסה המנוע של תרבות התאים.
הסר את צלחת שש באר מן החממה פלטפורמה, לאבטח את המכסה המקורי של הצלחת, ולאשר מפגש התא באמצעות מיקרוסקופ, ולאחר מכן למקם את צלחת שש באר עם תאים confluent בחזרה באינקובטור פלטפורמה בתוך מכסה המנוע תרבות התא. הכנס שלושה צינורות Tygon לחתוך מראש בכל באר דרך היציאות מוטבע על ידי שטיפת הצינורות אל קירות הבאר ולאבטח אותם עם טבעות מודפסות 3D מותאם אישית. הכן סקריפט תוכנת אינטגרציה לנסיגת משאבה.
השתמש במשאבה פריסטלית אחת כדי להסיר לחלוטין את מדיית התא מכל שש הבארות. ממיסים ראשוניים בכל ערוץ של שלוש המשאבות הפריאסטליות האחרות, ואז להחדיר מי חמצן ומאגר Quench בצינורות לסירוגין שלהם בהתאמה עד ריאגנטים להגיע ליציאות האינקובטור. ודא שקרן הלייזר זוויתית כראוי ומגיעה לאינקובטור ללא מעצורים.
בדוק אנרגיית לייזר באמצעות חיישן חיצוני. הכינו את סקריפט תוכנת האינטגרציה לעירוי משאבה לאחר אישור יישור הקרן. להחדיר 200 מי חמצן מילימולארי ב 35 מיליליטר לדקה לתוך הבאר הראשונה.
לחץ על לחצן 'התחל' בתוכנת הלייזר בסימן חמש השניות כדי להפעיל את הדופק בסימן 11 השניות על שעון העצר. להחדיר 125 מילימולאר Quench פתרון ב 35 מיליליטר לדקה לתוך הבאר הראשונה מיד לאחר פולס לייזר. הזז ידנית את שלב המיקום כדי ליישר את הבאר הבאה עם קרן הלייזר ולחזור על התהליך עבור כל הבארות.
במכסה המנוע של תרבות התא, השתמש במגרד תאים כדי להעביר את התאים מכל באר לצינורות חרוטים בודדים של 15 מיליליטר. תאי צנטריפוגה ב 1, 200 פעמים G במשך חמש דקות. השלך את supernatant ו resuspend התאים ב 100 microliters של מאגר תמוגה RIPA.
להעביר תאים בודדים 1.2 מיליליטר פוליפרופילן צינורות. פלאש להקפיא את כל הדגימות חנקן נוזלי ומניחים אותם במקפיא מינוס 80 מעלות עד השימוש. כדי להתאים שינויים FPOP, לנתח את lysate התא מתעכל באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית, ולאחר מכן לחשב את היקף השינוי.
כדי לאשר שתנאי החממה של הפלטפורמה מספיקים לתרבות התאים בפלטפורמת הלייזר, GCaMP2 הוחלף באופן ארעי לתוך HEK293T ויעילות transfection עבור שני הלוחות הוערכה באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. בוצעה בדיקת לוציפראז לכמות יעילות ההעתקה. שינויים FPOP בתאי HEK293T שכותרתו במערכת הזרימה הושוו לאלה המסומנים בחממה פלטפורמה.
חממת הפלטפורמה עלתה על מערכת הזרימה הן במספר החלבונים ששונו והן בכיסוי FPOP הכולל בחלבונים אלה. במערכת הזרימה זוהו שני פפטידים ששונו, המספקים מידע מבני מוגבל. עם זאת, חמישה פפטידים מותאמים המשתרעים על רצף האקטין זוהו באינקובטור הפלטפורמה.
ספקטרום טנדם MS של actin עם פרולין שונה בשתי המערכות ופפטיד actin ללא שינוי מוצגים כאן. שאריות FPOP ששונו בדגימות החממה של הפלטפורמה הכילו 12 שאריות ששונו, שלוש שאריות ששונו במערכת הזרימה ושאריות שונה חופפות. ניתוח LC-MS MS גילה כי 792 חלבונים שונו על ידי in vivo FPOP בחממת הפלטפורמה בהשוואה ל-545 החלבונים ששונו עם מערכת הזרימה.
זה הכרחי כדי לשמור על תאים בתנאים סטריליים. תמיד להביא את החממה פלטפורמה לתוך מכסה המנוע תרבות התא סטרילי להכניס את כל צלחות שש באר הדרושים, צינורות, וטבעות. זה מבטיח את שלמות הניסוי.
