פרוטוקול זה משתמש באסטרטגיית תרבית תרחיף סטטי להבחנה של אבות הלבלב לצברי איונים, מפחית את הלחצים שתאים חווים במהלך תרבית רעידה, ומשפר מאוד את הצלחת ההתמיינות. פרוטוקול החומרה ידידותי למתחילים, וחוסך זמן לאופטימיזציה של ארבעת השלבים הראשונים. אנשי צוות עם טכניקות בסיסיות של תרבית תאי גזע יכולים לשחזר פרוטוקול זה עם סיכוי טוב ליצור אשכולות פונקציונליים דמויי איון.
כדי להתחיל, תרבית פרווה בארות עם מטריג'ל מוסמך hESC מדולל ב- DMEM/F12 קר כקרח ומניחים את הצלחת באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. שאפו את המדיום המושקע מתרבית hPSC ושטפו פעם אחת עם DPBS. נתקו תרבית hPSC לתאים בודדים עם אנזים דיסוציאציה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות.
לאחר הדיסוציאציה, שטפו את התאים על ידי הוספת מדיום DMEM/F12 חם והעבירו אותם לצינור חרוטי של 15 או 50 מיליליטר. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 G למשך חמש דקות ולהשהות מחדש את הגלולה בתווך מלא של תאי גזע המכיל 10-מיקרומולרי Y-27632. לאחר מכן, בצע ספירת תאים חיים באמצעות המוציטומטר.
לאחר ספירת המטריגל המדולל ומיד לזרוע תאים חיים בצפיפות של 1.6 עד 1.8 כפול 10 עד חמש לסנטימטר רבוע על בארות מצופות מטריג'ל. לדגור על התאים באינקובטור לח במשך 24 שעות. לאחר מכן, בשלב הראשון, ביום הראשון, הכינו את שלב 1A בינוני.
החלף את המדיום המשומש במדיום שלב 1A ודגר במשך 24 שעות. למחרת, להחליף את המדיום משומש מן הבארות עם מדיום שלב 1B מוכן טרי. בשלב השני, היום הראשון, הכינו את מדיום שלב 2A והחליפו את המדיום מבארות במדיום שלב 2A.
לדגור במשך 24 שעות לפני הוספת שלב 2B בינוני לתוך הבארות; שלב שלישי, יום ראשון, שואפים את המדיום המשומש מבארות, ואז מוסיפים מדיום שלב 3 טרי ודוגרים באינקובטור לח. בשלב הרביעי, היום הראשון, החליפו את המדיום המשומש במדיום שלב 4 שהוכן זה עתה ודגרו באינקובטור לח. בשלב הרביעי, היום החמישי, טפלו במיקרו-בארות עם 500 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה נגד היצמדות לכל באר.
צנטריפוגו את צלחת המיקרווול ב 1, 300 G במשך חמש דקות והתבוננו תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח שלא נלכדו בועות אוויר במיקרו-בארות. לאחר מכן, שאפו את תמיסת השטיפה מהבארות ושטפו פעם אחת במיליליטר אחד של DPBS. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיום צבירה לכל באר.
לאחר הסרת המדיום בילה מן תרביות אב הלבלב, לשטוף את התרבית פעם אחת עם DPBS לפני dissociating לתוך תאים בודדים עם מגיב דיסוציאציה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 12 דקות. שטפו את התאים עם DMEM/F12 חם והעבירו אותם לצינור לצנטריפוגה ב-300 גרם למשך חמש דקות. השהה מחדש את הגלולה בתווך הצבירה ובצע ספירת תאים חיים.
זרעו 2.4 עד 3.6 מיליון תאים לבאר והוסיפו מדיום צבירה לכל באר כדי להשיג נפח סופי של שני מיליליטר לכל באר. בעזרת קצה פיפטה P-1000, החזירו בעדינות את התאים למעלה ולמטה לפיזור אחיד. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 G במשך חמש דקות כדי ללכוד את התאים במיקרובארות ולדגור באינקובטור לח במשך 24 שעות כדי להתחיל צבירה.
לאחר הצבירה, החזירו בעדינות את הצברים למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לצוף תאים שאינם מצטברים. לאחר שהאגרגטים מתיישבים, הסר בזהירות את המדיום המושקע המכיל תאים צפים שאינם צברים מבלי לשאוף אגרגטים. יש לפזר מדיום שלב 5 טרי על פני השטח של צלחת המיקרווול כדי לעקור אגרגטים מהמיקרו-בארות, ולהעביר אותם לצלחת בעלת שש בארות בעלת חיבור נמוך במיוחד.
לאחר איסוף כל האגרגטים בשש בארות חיבור אולטרה נמוך, להשעות אותם בשלב 5 בינוני כדי להתאים את הצפיפות ל 20 אשכולות לכל 100 מיקרוליטר. לאחר מכן, באמצעות פיפטה רב ערוצית, לפזר 50 מיקרוליטר של שלב 5 בינוני לתוך כל באר של חיבור נמוך במיוחד ULA שטוח תחתית 96 באר לוחית. מלא את בארות הפינה והקצה עם 200 מיקרוליטר של DPBS.
ערבבו בעדינות את מתלי האשכול בכל פעם לפני הניפוק. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של השעיית אשכול לתוך כל באר של צלחת 96-באר שטוחה ULA. הניחו את לוחות התרבית על משטח ישר באינקובטור לח למשך 24 שעות.
למחרת או בשלב חמש, היום השני, באמצעות פיפטה רב ערוצית, להסיר בעדינות 90 מיקרוליטר של המדיום בילה מכל באר ולרענן עם 100 מיקרוליטר של שלב 5 בינוני. בשלב השישי, היום הראשון, להחליף את 90 מיקרוליטר של מדיום משומש עם 100 מיקרוליטר של מדיום שלב 6 לכל באר. בשלב השביעי, היום הראשון, הסר את המדיום המשומש והוסף 100 מיקרוליטר של מדיום שלב 7 לכל באר.
במחקר זה, באמצעות לוחות מיקרו-באר, נוצרו בו זמנית אלפי צבירי אבות לבלב בעלי גודל ומורפולוגיה אחידים, ויעילות הצבירה הממוצעת הייתה סביב 74%. חשוב לציין כי ביטוי PDX1 ו-NKX6.1 נשמר ברמות גבוהות בצבירים אלה לאחר הצבירה. תאים המבטאים אינסולין הושרו בהדרגה בתוך אשכולות אנדוקריניים, כפי שצוין על ידי אותות GFP אינסולין מוגברים בתרביות חיות לאורך זמן. גודל הצביר גדל מקוטר ממוצע של 150 מיקרון ל-220 מיקרון בין שלבים חמש לשבע.
אפיון הרכב התא מראה כי איי hPSC בשלב שבעת הנוצרים על ידי הפרוטוקול ההיברידי היו בעיקר אנדוקריניים, והורכבו מארבעה סוגי תאי איון עיקריים. פרוטוקול היברידי זה יצר בעיקר תאי איון מונו-הורמונליים ומיעוט של תאים בי-הורמונליים. תאי בטא מתמיינים מבטאים NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 ו-GLUT1.
יתר על כן, 60% תאים חיוביים כפולים אינסולין ו- PDX1 ו- 50%C-peptide ו- NKX6.1 תאים חיוביים כפולים הושרו בשלב 7. במבחנה, בדיקות הפרשת אינסולין סטטיות המעוררות גלוקוז הראו כי איי hPSC בשלב השביעי מפרישים רמות אינסולין גבוהות בתגובה לגלוקוז גבוה ודפולריזציה ישירה. תכולת האינסולין הכוללת של איי hPSC היא כמחצית מכמות האיים הקדווריים.
מערכת התרביות הסטטיות המבוססת היטב ליצירת איים שמקורם בתאי גזע מאפשרת בדיקות שונות באתרן, ויכולה לשמש פלטפורמה מתאימה לפיתוח פרוטוקולים ולמחקרי סינון בקנה מידה קטן. כדי למזער את היתוך הצביר במהלך תרבית סטטית בלוח 96 בארות, אין להטות את הצלחת בעת ביצוע השינוי הבינוני. שמור תמיד את הצלחת אופקית על משטח ישר.
