היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שלפני הגירוי, התאים מפוזרים באופן שווה ולאחר מכן מגורה באופן שווה בהיתוך תאים דו-מושביים. הדגמת ההליך תהיה אזומה קימורה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בהליך זה, להעביר שישה מיליליטר של RPMI 1640 לתוך צינור מקורר לארבע מעלות צלזיוס על קרח.
בעזרת טיפים מקוררים של פיפיטר אחד מיליליטר, הוסיפו שני מיליגרם של מטריצת קרום מרתף. מערבבים היטב על ידי צינורות עדינים כדי להפוך אותו מטריצת קרום מרתף עם ריכוז של 0.33 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן, השתמשו בפיגט כדי להעביר שני מיליליטר של מטריצת קרום המרתף המדוללת לכל באר של צלחת תרבות תאים בת שש בארות.
דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 עד 90 דקות. לאחר מכן, לשמור על הצלחת בטמפרטורת החדר עד שלוש שעות, עד מוכן לשימוש. ראשית, שאפו את המדיום המשמש והשתמשו בפיפטה כדי להוסיף שני מיליליטר של EDTA 0.5 מילימולר לכל באר כדי לשטוף את hPCSs בתרבות בצלחת שש בארות.
לאחר מכן, שאפו את ה- EDTA מה בארות והוסיפו שני מיליליטר של EDTA טרי 0.5 מילימולר לכל באר. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, שאפו את ה-EDTA מכל באר.
הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום תחזוקת hPSC בטמפרטורת החדר, בתוספת 10 מיקרומולרים Y27632 לכל באר. פיפטה בעדינות אך במהירות כדי לפוצץ את התאים המחוברים על הצלחת כדי לנטרל את כל התאים מקובצים לתאים בודדים. העבר את ההשעיה התא בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של אמצעי תחזוקה hPSC בתוספת 10 micromolar Y27632 ל הבאר לערבב על ידי pipetting.
לאחר מכן, מערבבים 15 מיקרוליטרים של השעיית תאים עם 15 מיקרוליטרים של כחול טריפאן בצינור. השתמש פיפסה 10 microliter להעביר 10 microliters של המתלים תא מדולל לתוך תא ספירת שקופיות כפולות. באמצעות מונה תאים אוטומטי, ספור את מספר התא וחשב את צפיפות התאים בהשעיית התא.
להקצות את ההשעיה התא לתוך צינור 50 מיליליטר בצפיפות של אחד עד מיליון וחצי תאים עבור כל באר לשמש. צנטריפוגה הצינור ב 200 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה כדי לשאפת את supernatant מחדש להשעות את התאים באמצעות מיליליטר אחד של שלב 1A בינוני ל הבאר.
בעדינות pipette ההשעיה התא ולאחר מכן להוסיף עוד מיליליטר אחד של שלב 1A בינוני ל הבאר. באמצעות פיפט 1000 מיקרוליטר, שאפו את מטריצת קרום המרתף המדוללת מ הבארות של צלחת תרבות התאים שהוכנה קודם לכן. מיד pipette ההשעיה בצינור בעדינות ולהעביר שני מיליליטר לתוך כל באר של צלחת שש באר.
מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור ומ מניחים את הצלחת על ספסל נקי בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, מעבירים בזהירות את הצלחת לאנקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ואטמוספירה לחה במשך 24 שעות. ראשית, לנער בעדינות את הצלחת ולהשתמש פיפטה כדי לשוכך את המדיום בשימוש.
לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של DPBS לכל באר. לנער בעדינות את הצלחת שוב ושואפים את DPBS בשימוש. מוסיפים ארבעה מיליליטר של שלב 1B בינוני, מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס, לכל באר.
מעבירים בזהירות את הצלחת לאנקובטור ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני ואטמוספירה לחה לתרבות למשך 48 שעות. לאחר מכן, לנער בעדינות את הצלחת ולוותר את המדיום בשימוש. הוסף שני מיליליטר של DPBS לכל באר.
חזור על שאיפה זו ותוספת של DPBS פעם נוספת. לנער בעדינות את הצלחת ושואפים את ה- DPBS המשמש. מוסיפים ארבעה מיליליטר של שלב 1B בינוני, מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס, לכל באר.
מעבירים בזהירות את הצלחת לאנקובטור, ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ואווירה לחה לתרבות במשך 24 שעות. ראשית, לנער בעדינות את הצלחת ולוותר את המדיום המשמש. הוסף שני מיליליטר של DPBS לכל באר של צלחת שש בארות.
לאחר מכן, לנער בעדינות את הצלחת ושואפים את DPBS בשימוש. מוסיפים ארבעה מיליליטר של שלב שני בינוני, מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס, לכל באר. מעבירים בזהירות את הצלחת לאנקובטור ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני ואווירה לחה לתרבות במשך ארבעה ימים.
מנערים בעדינות את הצלחת ושווים את המדיום המשמש. הוסף שני מיליליטר של DPBS לכל באר. חזור על תהליך זה של שאספירה והוספת DPPS פעם נוספת.
לאחר מכן, לנער בעדינות את הצלחת ולופות את DPBS בשימוש. מוסיפים ארבעה מיליליטר של שלב שלוש בינוני, מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס, לכל באר. מעבירים בזהירות את הצלחת לאנקובטור ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני ואווירה לחה לתרבות למשך שלושה ימים.
במחקר זה, hIPSEs הפצה מרוכזים ויוצרים monolayer הומוגני שמתאים ההידול. hIPSEs מופקדים ניתוקים ונזרעים מחדש כתאים בודדים בצפיפות תאים נמוכה. תוך שעה, התאים מחוברים לצלחת ומתחילים להראות בלט.
ביום הראשון, התאים מתרבים ומופצים היטב כדי לכסות 80 עד 90% משטח הפנים. בימים 3 ו-4, התאים יוצרים גיליון מונוליאר הומוגני שניתן לתארו כמקרה מרוצף אבן. בשלב זה, רוב התאים להפסיק להביע SOX2, שהוא סמן עבור תאים מופקים, ובמקום לבטא סמן endoderm סופי, SOX17, על יותר מ 90%רוב התאים SOX17 חיובי לבטא FOXA2.
ואז התאים מתחילים לבטא את סמני goptupe פרימיטיבי, HNF1-בטא ו HNF4-אלפא, ובסופו של דבר להביע סמן הלבלב הלבלב החוץ רחמי, PDX1, ב יותר מ 90%TDX1 חיובי אינדוקציה התא הוא רבייה בקו hIPSE אחר, 1231A3, ו קו hESE, KhES-3. תוצאות QRTPCR של ביטוי MRNA של סמני שלב עולים בקנה אחד עם immunostaining ואת ביטוי MRNA של PDX1 ניכר בשלב שלוש ועליות משמעותיות לאחר מכן. מאז תאי ESIPS מו מווסתים גדלים כמושבות, תאים בודדים נמצאים באופן מקומי במצב שונה.
פרוטוקול זה מספק דרך לעורר תאים באופן שווה עבור ההתברמות שנבחרה.
