המנגנונים של צבירת חלבונים נחקרו עד כה בעיקר במבחנה. עם הפרוטוקול שלנו אנחנו יכולים לעשות מחקרים כמותיים דומים במודל אורגניזם C.elegans. היתרון העיקרי של השיטה שלנו הוא כימות לא משוחד של מספרי הכללה.
ועל ידי התאמת נתונים באיכות גבוהה אלה, למודלים מתמטיים, אנו יכולים לקבל תובנות על מנגנון הצבירה. צבירת חלבונים מתרחשת במחלות רבות, כולל אלצהיימר והנטינגטון. הבנת המנגנון המולקולרי של צבירת חלבונים ב- vivo חיונית לפיתוח טיפולים חדשים.
התחילו בהנחת 10 נמטודות בוגרות על צלחת NGM בעלת 6 ס"מ עם פיק תולעים מפלטינה לביצוע הטלת ביצים מסונכרנת. השאירו את המבוגרים להטיל ביצים במשך כשעתיים בשעה 20 C לפני הסרתם מהצלחת. מניחים את הצלחות עם הביצים באינקובטור בשעה 20 C.Monitor על התפתחות בעלי החיים עד שהם מגיעים לבגרות בערך ביום השלישי לאחר הטלת הביצה.
הכן את צלחת 384-well על ידי מילוי המספר הנדרש של בארות עם 100 L של M9 חוצץ בתוספת 25 mM נתרן אזיד כמו הרדמה. מלאו באר אחת לכל זן כדי להיות בתמונה. עבור כל זן, להעביר 20 בעלי חיים לתוך באר אחת באמצעות פיק תולעת פלטינה.
מכסים את הצלחת במכסה לאידוי מונע, ומדמיינים את הצלחת תוך שעה לאחר ההכנה. הפעל את המכשיר ופתח את התוכנה. לחץ על כפתור ההפעלה לצד פרק לוחות באר, והנח את הצלחת של 384 הבאר במיקרוסקופ.
תחת רשימת פעולות ורכישת פלואורסצנטיות תלת-ממדית, לחץ על בדוק ובחר את התולעים המכילות היטב. הגדר את עיבוד התמונה כ'ללא'. ולחץ על לחצן הפעל כדי לקבוע את מרחק השינוי האופטימלי שבו התולעים ממורכזות כראוי.
הגדר מרחק עולה ל- 50 מ ', מרחק יורד ל- 50 מ ', ומרווח חיתוך ל- 2 מ 'כדי ללכוד את כל העובי של בעלי החיים בערימת z. הגדר את עיבוד התמונה בחזרה למקסימום. בחר את הבארות שיש לצלם תחת הגדרת סריקת צלחת היטב.
ולאחר מכן בחר אריחים ורכוש באר שלמה. שמור את הגדרת המדידה. ולחץ על התחל מדידה כדי להתחיל בניסוי.
פתח את CellProfiler וגרור את הצינור לחלון שחרר קובץ צינור כאן. לחץ על כן כדי לטעון את הפרוייקט. לאחר מכן, גרור את התמונות התפורות לחלון שחרר קבצים ותיקיה כאן.
לחץ על מודול קלט המטה-נתונים. התאם את הביטוי הרגיל כדי לחלץ משם הקובץ בהתאם לשמות התמונות התפורות. לחץ על מודול הקלט NamesAndTypes והתאם בחר את קריטריוני הכלל כך שיתאימו לערוצים בשמות הקבצים.
לאחר מכן, לחץ על הגדרות פלט כדי לבחור תיקיה לשמירת הפלט מ- CellProfiler. לחץ על התחל מצב בדיקה כדי לבדוק את ההגדרות של הצינור באמצעות ערכת נתוני ההדמיה הראשונה. לחץ על שלב כדי לרוץ דרך הצינור, מודול אחד בכל פעם.
כדי להתאים את קווי המתאר של התולעת, לחץ על הצג עזרה במודול EditObjectsManually כדי לראות את ההוראות. תקן את קווי המתאר. ולאחר מכן לחץ על בוצע כדי להמשיך להפעיל את הצינור.
לחץ על צא ממצב בדיקה וניתח תמונות. פתח את תיקיית הפלט כדי להציג את קבצי הפלט. ופתח את התמונות עם שם הקובץ המקורי ואחריו קווי מתאר כדי לבדוק אם התולעים וההכללות היו מכוסות כראוי.
כדי להתחיל להשתמש ב- AmyloFit, תן שם לפרוייקט ולחץ על צור פרוייקט. לחץ על פתח כדי לפתוח אותו. וליצור הפעלה על-ידי מתן שם ולחיצה על יצירה וטעינה של הפעלה.
לחץ על הוסף נתונים והעלה את הקובץ המכיל את המספרים הממוצעים של תכלילים לכל בעל חיים, בהתאם לדרישות תבנית הנתונים המוצגות בחלונית הימנית. לאחר מכן, לחץ על טען נתונים חדשים. הגדר את מספר הנקודות לממוצע עבור היסט נקודת אפס ל- 0, והגדר את מספר הנקודות לממוצע עבור הרמה ל- 0 כדי לדלג על שלבי טרום העיבוד, שאינם נדרשים עבור נתוני ספירת הכללה.
לאחר מכן, לחץ על שלח. חזור על שלב זה עבור כל ריכוז חלבון. בחרו 'מותאם אישית' בחלונית 'דגם'.
הזן את המשוואה עבור התגרענות עצמאית בתיבה משוואה. ולחץ על טען מודל. עבור Ncells, הגדר את סוג הפרמטר כ- Global Constant והגדר את Value ל- 95, בהתאם למספר תאי השריר של דופן הגוף.
הגדר את סוגי הפרמטרים כהתאמה כללית עבור Kcell ו- n. ולקונסטנט עבור m. הזינו את הערכים של m לזנים השונים בחלונית השמאלית.
השאירו את מספר דילוגי האגן ללא שינוי ולחצו על 'התאם' בחלונית 'התאמה'. לבסוף, לחלץ את ההתאמה על ידי לחיצה על הורד נתונים ולהתאים. מספרי ההכללה היו במעקב בארבעה זני C.elegans המבטאים ריכוזי Q40 שונים.
מודל התגרענות העצמאי מתאר היטב את הקינטיקה של הצבירה. ההתאמה הניבה סדר תגובה של 2.1, וקצב התגרענות של 0.38 מולקולות ליום לתא בריכוז חלבון תאי של 1 מ"מ. שני שכפולים ביולוגיים עצמאיים במחקר קודם הראו ערכים תואמים באופן הדוק לסדר התגובה ולשיעור התגרענות.
דבר אחד שיש לזכור הוא שאתה צריך ערכות נתונים באיכות גבוהה עבור ריכוזי חלבון מרובים כדי להשיג התאמות אמינות. שיטה זו יכולה לשמש כדי למצוא דרכים להפריע לצבירה של חלבונים באורגניזם חי, כגון נוקאאוטים גנטיים או טיפולים במולקולות קטנות.
