Механизмы агрегации белка до сих пор исследовались в основном in vitro. С помощью нашего протокола мы можем проводить аналогичные количественные исследования в модельном организме C.elegans. Основным преимуществом нашего метода является объективная количественная оценка чисел включения.
И подгоняя эти высококачественные данные к математическим моделям, мы можем получить представление о механизме агрегации. Агрегация белка происходит при многих заболеваниях, включая болезнь Альцгеймера и Болезнь Хантингтона. Понимание молекулярного механизма агрегации белка in vivo имеет решающее значение для разработки новых методов лечения.
Начните с размещения 10 взрослых нематод на 6-сантиметровую посеянную пластину NGM с платиновым червячным отмычком для выполнения синхронной яйцекладки. Оставьте взрослым отложить яйца примерно на два часа при 20 С, прежде чем удалить их из тарелки. Поместите тарелки с яйцами в инкубатор при 20 С.Следите за развитием животных, пока они не достигнут совершеннолетия примерно на третий день после яйцекладки.
Подготовьте плиту из 384 скважин, заполнив необходимое количество скважин 100 л буфера М9, дополненного 25 мМ азида натрия в качестве анестетика. Заполните по одной лунке для каждого штамма для получения изображения. Для каждого штамма переведите 20 животных в одну скважину с помощью платинового червячного кирка.
Накройте пластину крышкой для предотвращения испарения и визуализируйте пластину в течение одного часа после приготовления. Включите прибор и откройте программное обеспечение. Нажмите кнопку «Воспроизвести» рядом с пунктом «Разгрузить колодезные пластины» и поместите пластину на 384 скважины в микроскоп.
В разделе Список действий и Получение 3D-флуоресценции нажмите кнопку Тест и выберите скважину, содержащую червей. Установите для параметра Обработка изображений значение Нет. И нажмите кнопку «Воспроизвести», чтобы определить оптимальное расстояние смещения, на котором черви правильно центрированы.
Установите расстояние по возрастанию на 50 м, расстояние по убыванию на 50 м и интервал нарезки на 2 м, чтобы захватить всю толщину животных в z-стеке. Установите для параметра Обработка изображений значение Максимальная. Выберите скважины для получения изображения в разделе Настройка сканирования плит скважины.
Затем выберите Плитка и Получить целый колодец. Сохраните настройку измерения. И нажмите кнопку Начать измерение, чтобы начать эксперимент.
Откройте CellProfiler и перетащите конвейер в окно Перетащить файл конвейера сюда. Нажмите кнопку Да, чтобы загрузить проект. Затем перетащите сшитые изображения в окно Перетащить файлы и папку здесь.
Щелкните модуль ввода метаданных. Настройте регулярное выражение для извлечения из имени файла в соответствии с именами сшитых изображений. Щелкните модуль ввода NamesAndTypes и настройте Критерии выберите критерии правила в соответствии с каналами в именах файлов.
Затем нажмите «Настройки вывода», чтобы выбрать папку для сохранения выходных данных из CellProfiler. Щелкните Запустить тестовый режим, чтобы проверить параметры конвейера с помощью первого набора данных образа. Щелкните Шаг, чтобы запустить конвейер по одному модулю за раз.
Чтобы настроить контуры червей, щелкните Показать справку в модуле EditObjectsManually, чтобы просмотреть инструкции. Исправьте контуры. Затем нажмите кнопку Готово, чтобы продолжить работу конвейера.
Нажмите «Выход из тестового режима» и «Анализ изображений». Откройте выходную папку для просмотра выходных файлов. И откройте изображения с исходным именем файла, за которым следуют контуры, чтобы проверить, правильно ли наложены черви и включения.
Чтобы начать использовать AmyloFit, назовите проект и нажмите Создать проект. Нажмите «Открыть», чтобы открыть его. И создайте сеанс, присвоив ему имя и щелкнув Создать и загрузить сеанс.
Нажмите «Добавить данные» и загрузите файл, содержащий среднее количество включений на животное, следуя требованиям к формату данных, показанным на левой панели. Затем нажмите Загрузить новые данные. Установите для параметра Число точек, которое необходимо усреднить для смещения нулевой точки, значение 0, а для параметра Число точек, которое необходимо усреднить для плато, значение 0, чтобы пропустить этапы предварительной обработки, которые не требуются для данных подсчета включений.
Затем нажмите «Отправить». Повторите этот шаг для каждой концентрации белка. Выберите Пользовательский на панели «Модель».
Введите уравнение для независимой нуклеации в поле Уравнение. И нажмите кнопку Загрузить модель. Для Ncells задайте тип параметра Global Constant, а для параметра Value — значение 95, соответствующее количеству мышечных клеток стенки тела.
Установите для типов параметров Значение Global fit для Kcell и n. И к Константе за м. Введите значения m для различных деформаций в левой панели.
Оставьте количество прыжков бассейна без изменений и нажмите кнопку «По размеру» на панели «Подгонка». Наконец, извлеките подгонку, щелкнув Загрузить данные и Подогнать. Показатели включения контролировали в четырех штаммах C.elegans, экспрессирующих различные концентрации Q40.
Независимая модель нуклеации хорошо описывает кинетику агрегации. Припадок давал порядок реакции 2,1 и скорость нуклеации 0,38 молекулы в день на клетку при внутриклеточной концентрации белка 1 мМ. Две независимые биологические реплики в предыдущем исследовании показали близко совпадающие значения для порядка реакции и скорости нуклеации.
Одна вещь, которую следует иметь в виду, заключается в том, что вам нужны высококачественные наборы данных для нескольких концентраций белка, чтобы получить надежные соответствия. Этот метод может быть использован для поиска способов вмешательства в агрегацию белка в живом организме, таких как генетические нокдауны или обработка малых молекул.
