تم التحقيق في آليات تجميع البروتين حتى الآن في الغالب في المختبر. مع بروتوكولنا يمكننا إجراء دراسات كمية مماثلة في الكائن الحي النموذجي C.elegans. الميزة الرئيسية لطريقتنا هي القياس الكمي غير المتحيز لأرقام التضمين.
ومن خلال ملاءمة هذه البيانات عالية الجودة، مع النماذج الرياضية، يمكننا الحصول على رؤى حول آلية التجميع. يحدث تراكم البروتين في العديد من الأمراض، بما في ذلك مرض الزهايمر وهانتنغتون. يعد فهم الآلية الجزيئية لتجميع البروتين في الجسم الحي أمرا بالغ الأهمية لتطوير علاجات جديدة.
ابدأ بوضع 10 ديدان خيطية بالغة على صفيحة NGM ببذور 6 سم مع اختيار دودة بلاتينية لإجراء وضع بيض متزامن. اترك البالغين يضعون البيض لمدة ساعتين تقريبا عند 20 درجة مئوية قبل إزالته من الطبق. ضع الأطباق مع البيض في الحاضنة في الساعة 20 م.راقب تطور الحيوانات حتى تصل إلى مرحلة البلوغ في اليوم الثالث تقريبا بعد وضع البيض.
قم بإعداد الصفيحة المكونة من 384 بئرا عن طريق ملء العدد المطلوب من الآبار ب 100 لتر من المخزن المؤقت M9 مع استكماله بأزيد الصوديوم 25 mM كمخدر. املأ بئرا واحدا لكل سلالة ليتم تصويرها. لكل سلالة ، انقل 20 حيوانا إلى بئر واحد باستخدام اختيار دودة البلاتين.
قم بتغطية اللوحة بالغطاء للتبخر الوقائي ، وقم بتصوير اللوحة في غضون ساعة واحدة بعد التحضير. قم بتشغيل الأداة ، وافتح البرنامج. انقر على زر التشغيل بجوار تفريغ لوحات الآبار ، ووضع لوحة 384 بئر في المجهر.
ضمن قائمة الإجراءات واكتساب التألق 3D، انقر فوق اختبار، وحدد الديدان التي تحتوي على البئر. اضبط معالجة الصور على لا شيء. وانقر فوق الزر تشغيل لتحديد مسافة التحول المثلى التي تتمركز فيها الديدان بشكل صحيح.
اضبط المسافة التصاعدية على 50 مترا، والمسافة التنازلية على 50 مترا، والفاصل الزمني للتقطيع على 2 متر لالتقاط سمك الحيوانات بالكامل في المكدس z. اضبط معالجة الصور مرة أخرى على الحد الأقصى. حدد الآبار المراد تصويرها ضمن إعداد مسح لوحة البئر.
ثم حدد البلاط والحصول على البئر بالكامل. احفظ إعداد القياس. وانقر فوق بدء القياس لبدء التجربة.
افتح CellProfiler واسحب خط الأنابيب إلى النافذة إسقاط ملف خط أنابيب هنا. انقر فوق نعم لتحميل المشروع. بعد ذلك ، اسحب الصور المخيطة إلى نافذة إسقاط الملفات والمجلد هنا.
انقر على وحدة إدخال البيانات الوصفية. اضبط التعبير العادي للاستخراج من اسم الملف وفقا لأسماء الصور المخيطة. انقر فوق وحدة إدخال NamesAndTypes ، واضبط تحديد معايير القاعدة لمطابقة القنوات في أسماء الملفات.
ثم انقر فوق إعدادات الإخراج لتحديد مجلد لحفظ الإخراج من CellProfiler. انقر فوق بدء وضع الاختبار للتحقق من إعدادات خط الأنابيب باستخدام مجموعة بيانات التصوير الأولى. انقر فوق خطوة لتشغيل عبر خط الأنابيب ، وحدة واحدة في كل مرة.
لضبط الخطوط العريضة للفيروس المتنقل ، انقر فوق إظهار التعليمات في الوحدة النمطية EditObjectsManually لرؤية التعليمات. تصحيح الخطوط العريضة. ثم انقر فوق تم لمتابعة تشغيل خط الأنابيب.
انقر فوق الخروج من وضع الاختبار وتحليل الصور. افتح مجلد الإخراج لعرض ملفات الإخراج. وافتح الصور باسم الملف الأصلي متبوعا بالخطوط العريضة للتحقق مما إذا كانت الديدان والتضمينات قد تم وضعها بشكل صحيح.
لبدء استخدام AmyloFit ، قم بتسمية المشروع وانقر فوق إنشاء مشروع. انقر فوق فتح لفتحه. وإنشاء جلسة عن طريق إعطائها اسما والنقر على إنشاء وتحميل الجلسة.
انقر فوق إضافة بيانات، وقم بتحميل الملف الذي يحتوي على متوسط أعداد التضمينات لكل حيوان، باتباع متطلبات تنسيق البيانات الموضحة في اللوحة اليمنى. ثم انقر فوق تحميل بيانات جديدة. قم بتعيين عدد النقاط إلى المتوسط فوق إزاحة نقطة الصفر إلى 0، وقم بتعيين عدد النقاط إلى المتوسط فوق الهضبة إلى 0 لتخطي خطوات المعالجة المسبقة، والتي ليست مطلوبة لبيانات حساب التضمين.
ثم انقر فوق إرسال. كرر هذه الخطوة لكل تركيز بروتين. حدد مخصص في لوحة النموذج.
أدخل معادلة النوى المستقل في مربع المعادلة. وانقر فوق تحميل النموذج. بالنسبة إلى Ncells، اضبط نوع المعلمة على Global Constant، واضبط القيمة على 95، المقابلة لعدد خلايا عضلات جدار الجسم.
قم بتعيين أنواع المعلمات إلى Global fit ل Kcell و n. وإلى ثابت ل م. أدخل قيم m للسلالات المختلفة في اللوحة اليمنى.
اترك عدد قفزات الحوض دون تغيير، وانقر فوق احتواء في لوحة التركيب. أخيرا ، قم باستخراج الملاءمة بالنقر فوق تنزيل البيانات و Fit. تم رصد أرقام التضمين في أربع سلالات C.elegans تعبر عن تركيزات Q40 مختلفة.
يصف نموذج النوى المستقل حركية التجميع جيدا. أسفر التناسب عن ترتيب تفاعل قدره 2.1 ، ومعدل نواة قدره 0.38 جزيء يوميا لكل خلية عند تركيز بروتين داخل الخلايا يبلغ 1 ملليمتر. أظهر اثنان من النسخ المتماثلة البيولوجية المستقلة في دراسة سابقة قيما متطابقة بشكل وثيق لترتيب التفاعل ومعدل النوى.
شيء واحد يجب أن يؤخذ في الاعتبار هو أنك تحتاج إلى مجموعات بيانات عالية الجودة لتركيزات البروتين المتعددة للحصول على نوبات موثوقة. يمكن استخدام هذه الطريقة لإيجاد طرق للتداخل مع تراكم البروتين في كائن حي ، مثل الضربات القاضية الجينية أو علاجات الجزيئات الصغيرة.
