Os mecanismos de agregação de proteínas foram investigados principalmente in vitro. Com nosso protocolo podemos fazer estudos quantitativos semelhantes no organismo modelo C.elegans. A principal vantagem do nosso método é a quantificação imparcial dos números de inclusão.
E ao encaixar esses dados de alta qualidade, em modelos matemáticos, podemos obter insights sobre o mecanismo de agregação. A agregação de proteínas ocorre em muitas doenças, incluindo Alzheimer e Huntington. Entender o mecanismo molecular da agregação de proteínas in vivo é crucial para o desenvolvimento de novas terapias.
Comece colocando 10 nematoides adultos em uma placa de NGM semeada de 6 cm com uma picareta de verme de platina para realizar um pino de ovo sincronizado. Deixe os adultos colocarem ovos por aproximadamente duas horas a 20 C antes de removê-los da placa. Coloque as placas com ovos na incubadora a 20 C.Monitore o desenvolvimento dos animais até chegarem à idade adulta aproximadamente no terceiro dia após o ovo-lay.
Prepare a placa de 384 poços preenchendo o número necessário de poços com 100 L de tampão M9 suplementado com azida de sódio de 25 mM como anestésico. Encha um poço por cepa a ser imageado. Para cada cepa, transfira 20 animais para um poço usando uma picareta de verme de platina.
Cubra a placa com a tampa até a evaporação preventiva e imagem a placa dentro de uma hora após a preparação. Ligue o instrumento e abra o software. Clique no botão Reproduzir ao lado de Placas de Descarga e coloque a placa de 384 poços no microscópio.
Em Action List e 3D Fluorescence Acquisition, clique em Teste e selecione o poço que contém worms. Definir processamento de imagem para Nenhum. E clique no botão Reproduzir para determinar a distância de mudança ideal na qual os worms estão centrados corretamente.
Definir distância ascendente a 50 m, distância descendente de 50 m e intervalo de corte de 2 m para capturar toda a espessura dos animais na pilha z. Defina o processamento da imagem de volta ao máximo. Selecione os poços a serem imagens na configuração de varredura de placas de poço.
E, em seguida, selecione azulejo e adquira whole well. Salve a configuração de medição. E clique em Iniciar a Medição para iniciar o experimento.
Abra o CellProfiler e arraste o pipeline para a janela de soltar um arquivo de pipeline aqui. Clique em Sim para carregar o projeto. Em seguida, arraste as imagens costuradas para a janela 'Soltar arquivos e pasta aqui'.
Clique no módulo de entrada Metadata. Ajuste a expressão regular para extrair do nome do arquivo de acordo com os nomes das imagens costuradas. Clique no módulo de entrada NamesAndTypes e ajuste Selecione os critérios de regra para corresponder aos canais nos nomes dos arquivos.
Em seguida, clique em Configurações de saída para selecionar uma pasta para salvar a saída do CellProfiler. Clique no Modo de Teste iniciar para verificar as configurações do pipeline usando o primeiro conjunto de dados de imagem. Clique em Passo para executar através do pipeline, um módulo de cada vez.
Para ajustar os contornos do worm, clique em Mostrar ajuda no módulo EditarObjectsManually para ver as instruções. Corrija os contornos. E, em seguida, clique em Done para continuar executando o pipeline.
Clique no modo de teste de saída e analise imagens. Abra a pasta de saída para visualizar os arquivos de saída. E abra as imagens com o nome do arquivo original seguido de contornos para verificar se os worms e inclusões foram corretamente sobrepostos.
Para começar a usar o AmyloFit, nomeie o projeto e clique em Criar projeto. Clique em Abrir para abri-lo. E crie uma sessão dando-lhe um nome e clicando na sessão Criar e carregar.
Clique em Adicionar dados e carregue o arquivo contendo o número médio de inclusões por animal, seguindo os requisitos de formato de dados mostrados no painel esquerdo. Em seguida, clique em Carregar novos dados. Defina o número de pontos para a média acima de zero-ponto para 0, e defina o número de pontos para a média acima para o planalto para 0 para pular as etapas de pré-processamento, que não são necessárias para dados de contagem de inclusão.
Em seguida, clique em Enviar. Repita este passo para cada concentração de proteína. Selecione Personalizado no painel Modelo.
Digite a equação para nucleação independente na caixa de equação. E clique no modelo Carregar. Para Ncells, defina o tipo de parâmetro como Global Constant e defina Valor para 95, correspondendo ao número de células musculares da parede corporal.
Defina os tipos de parâmetros para o ajuste global para Kcell e n. E para Constant para m. Digite os valores de m para as diferentes cepas no painel esquerdo.
Deixe o número de lúpulos da bacia inalterado e clique em Encaixar no painel Encaixe. Por fim, extraia o ajuste clicando em Dados de Download e Ajuste. Os números de inclusão foram monitorados em quatro cepas de C.elegans expressando diferentes concentrações do Q40.
O modelo de nucleação independente descreve bem a cinética de agregação. O ajuste rendeu uma ordem de reação de 2,1, e uma taxa de nucleação de 0,38 moléculas por dia por célula a uma concentração de proteína intracelular de 1 mM. Duas réplicas biológicas independentes em um estudo anterior mostraram valores intimamente correspondentes para a ordem de reação e taxa de nucleação.
Uma coisa que deve ser mantida em mente é que você precisa de conjuntos de dados de alta qualidade para múltiplas concentrações de proteínas para obter ajustes confiáveis. Este método pode ser usado para encontrar maneiras de interferir com a agregação de proteínas em um organismo vivo, como knockdowns genéticos ou tratamentos de pequenas moléculas.
