Hücre altı çözünürlük ve kimyasal özgüllük ile biyolojik dokuların in Vivo görüntülenmesi, hücresel metabolizma, bağışıklık tepkisi ve doku yeniden şekillenmesinde yer alan dinamik süreçleri anlamak için güçlü bir araçtır. Kombine iki foton floresansı ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu ile, biyolojik dokuların kritik biyokimyasal ve biyofiziksel bilgileri, hücre altı çözünürlükle çoklu perspektiflerden elde edilebilir. Spesifik olarak, bu çift modlu mikroskopi, nörodejeneratif hastalıkların ve omurilik yaralanmasının ilerlemesini incelemek için fare omuriliğindeki hücresel dinamikleri ve etkileşimleri görüntülemek için kullanılabilir.
Başlamak için, tuş düğmesini bekleme modundan açık konuma getirerek titanyum safir lazeri açın ve lazerin ısınması için 30 dakika bekleyin. Ardından, OPO kontrol panelindeki başlat düğmesine tıklayarak OPO'yu açın ve lazerin ısınması için 20 dakika bekleyin. Pikosaniye lazer ısındıktan sonra, Stokes ışınının gücünü yaklaşık 20 miliwatt'a düşürerek, Stokes ışını için lazer deklanşörünü açarak ve ışını algılamak için OPO çıkışına yüksek hızlı bir fotoğraf dedektörü yerleştirerek Stokes ışınının modülasyon derinliğini kontrol edin.
Ardından, lazer darbesini izlemek için BNC konektörlü bir koaksiyel kablo kullanarak fotodetektörün çıkış portunu bir osiloskopun giriş portuna bağlayın. Ardından OPO kontrol yazılımında EOM kontrol penceresini açın ve 20 megahertz'de maksimum modülasyon derinliği elde etmek için EOM gücünü ve fazını osiloskopta gösterilen darbe yoğunluğu diyagramına göre ayarlayın. OPO kontrol yazılımında, Stokes çıkışını durdururken pompa lazer deklanşörünü açın.
Ardından, pompa ışınının dalga boyunu 796 nanometreye ayarlamak için sinyal kutusunu ayarlayın, ardından OPO güç kutusunu ayarlayın ve gücünü optik hizalama için minimuma ayarlamak üzere 20 girin. Daha sonra, P1 hizalama plakasını polarize edici ışın ayırıcının arkasına yaklaşık 10 santimetreye yerleştirin ve P2 plakasını optik yolda yaklaşık 30 santimetrede P1'in arkasına yerleştirin. Pikosaniye lazer ışını için mikroskop deklanşörünü açtıktan sonra, P1'in içinden geçen delikteki pikosaniye lazer ışını merkezini bulmak için ayna M1'i ayarlayın. M1 aynasını ayarlarken P1'deki ışın noktasının konumunu gözlemlemek için kızılötesi bir kapsam kullanın. Benzer şekilde, P2'nin geçiş deliğindeki pikosaniye lazer ışını merkezini bulmak için ayna M2'yi ayarlayın. M2 aynasını ayarlarken P2'deki ışın noktasının konumunu gözlemlemek için kızılötesi kapsamı kullanın. Pikosaniye ışın merkezi her iki hizalama plakasının içinden geçen deliğe yerleşene kadar aynaları ayarladıktan sonra, mikroskop kontrol yazılımındaki pikosaniye ışınının deklanşörünü kapatın.
Ardından, femtosaniye lazer ışını için mikroskop deklanşörünü açın. P1'in geçiş deliğindeki femtosaniye lazer ışını nokta merkezini bulmak için ayna M3'ü ayarlayın, ardından P2'nin geçiş deliğindeki femtosaniye lazer ışını nokta merkezini bulmak için ayna M4'ü ayarlayın. Femtosaniye lazer ışını merkezi iki hizalama plakasının içinden deliklere yerleşene kadar aynaları ayarladıktan sonra, femtosaniye ışını için mikroskop deklanşörünü kapatın. Ardından, iki ışın noktasının konumunu görselleştirmek ve pompa ışınının kamera ekranındaki konumunu referans olarak işaretlemek için hedefin konumuna bir kamera yerleştirin.
Ardından, L3 lensinin önüne bir P0 hizalama plakası yerleştirin ve optik aynayı bir altıgen anahtar kullanarak ayarlayın, böylece Stokes ışın merkezi, lazer çıkış portundaki hizalama plakasının içinden geçen delikten geçer. Ayarlama sırasında P0'daki ışın noktasının konumunu onaylamak için kızılötesi kapsamı kullanın. Ardından, P0 hizalama plakasını çıkarın ve optik aynayı iki olarak ayarlamak için altıgen tuşunu kullanın, böylece Stokes ışınının merkezi, kamera üzerindeki pompa ışınının referans işaretiyle birlikte lokalize olur.
Stokes ışını hem P0 hem de kamera düzlemlerindeki pompa ışını ile kesinlikle örtüşene kadar aynaları ayarlamaya devam edin. Kilitli amplifikatör kontrol yazılımını açın ve pompa lazerinin dalga boyunu 796 nanometreye ve pompanın ve Stokes ışınının gücünü, numune üzerinde sırasıyla 15 ve 25 miliwatt'a karşılık gelen 50 ve 70 miliwatt'a ayarlayın. Daha sonra kilitleme amplifikatörü faz optimizasyonu için zeytinyağı kullanın.
Zeytinyağı, sinyal geri saçılımını veya EPI-SRS tespitini arttırmak için tabana tutturulmuş kağıt mendil ile bir slaytta kapatılır. Zeytinyağı örneğini sahneye yerleştirin ve 25X hedefinin odağını numuneye ayarlayın. Mikroskop kontrol yazılımını kullanarak, görüntüleme parametrelerini metin yazısında belirtildiği gibi ayarlayın.
Ardından, kilitli amplifikatör kontrol yazılımını kullanarak, zaman sabiti değerini 10 mikrosaniyeye ayarlayın. Daha sonra, lazer ışınını numune üzerinde tarayın ve SRS sinyal yoğunluğu maksimuma ulaşana kadar fazı 22,5 derecelik bir adım boyutuyla ayarlayın. Ardından, lazer deklanşörü kapalıyken numuneyi tarayın ve ortalama SRS sinyali sıfıra yakın olana kadar ofset değerini bir milivoltluk bir adım boyutuyla ayarlayın.
Ardından, OPO kontrol yazılımında gecikme yöneticisi iletişim kutusunu açın ve zeytinyağını tarayın, zeytinyağı SRS sinyali maksimuma ulaşana kadar gecikme aşamasını ayarlayın. Ardından taramayı durdurun ve geçerli gecikme verilerini kaydetmek için gecikme yöneticisi iletişim kutusundaki veri ekle düğmesine tıklayın. Çeşitli kimyasal örnekleri görüntüleyerek farklı Raman kaymalarında benzer şekilde gecikme verilerini elde ettikten sonra, mevcut veri noktalarını beşinci dereceden polinom fonksiyonuna uydurmak için gecikme yöneticisi iletişim kutusunda beşinci sıraya uygun verileri seçin.
Ardından, özel olarak kullan düğmesine tıklayarak ve onay kutusunu işaretleyerek takılan verileri uygulayın. Gecikme aşaması, takılan gecikme eğrisine göre farklı dalga boylarında otomatik olarak ayarlanır. İn vivo görüntüleme için, fareyi omuriliği açıkta ve saline batırılmış halde stabilizasyon aşamasına sabitleyin.
Şimdi stabilizasyon aşamasını TPEF-SRS mikroskobunun altındaki beş eksenli bir aşamaya monte edin. Ardından fare kafasını iki kafa çubuğuyla sabitleyin ve nefes alma sırasında göğüs hareketi için yeterli alan sağlamak için tutma plakasını indirin ve hareket artefaktlarını hafifletin. Daha sonra, omurilik vaskülatürünün Brightfield görüntüsü 10X hedefi altında gözlemlenene kadar odağı ayarlamak için Z-translasyonel aşamasını ayarlayın.
Beş eksenli aşamanın iki eksenli translasyonel aşamasını ayarlayarak omurilik dorsal venini görüş alanının merkezine yerleştirin. Ardından, omurilik dorsal yüzeyini Brightfield görüntüsüne göre objektif eksene dik olarak ayarlamak için beş eksenli aşamanın rulo ve perde açılarını ayarlayın. Ardından TPEF-SRS görüntüleme için 10X'i 25X suya daldırma hedefiyle değiştirin.
SRS görüntüleme için, motorlu palete bağlı anahtar düğmesine basarak hedefin üzerindeki polarize edici ışın ayırıcıyı seçin. TPEF görüntüleme için, motorlu palete bağlı anahtar düğmesine basarak hedefin üzerindeki dikroik ayna D2'yi seçin. Son olarak, görüntüleme parametrelerini metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın ve örneği taramaya başlayın.
Fare omuriliğindeki seyrek etiketli YFP aksonlarının ve miyelin kılıflarının in vivo dual-modal görüntülenmesi, aksonların kalın bir miyelin kılıf tabakası ile yakından sarıldığını ortaya koymuştur. TPEF-SRS omurilik görüntüsünde görülebileceği gibi, Ranvier'in düğümleri aksonal çapı azalmıştır ve aksilemma doğrudan hücre dışı matrise maruz kalmıştır. Floresan ve SRS görüntüleme için yeni problar ile birleştirildiğinde, iki foton uyarılmış floresan SRS mikroskobu, çeşitli biyomoleküllerin eşzamanlı yapısal ve fonksiyonel görüntülemesini sağlayarak karmaşık biyolojik süreçleri anlamamızı kolaylaştırabilir.
