細胞内分解能と化学的特異性を備えた生物学的組織のIn Vivoイメージングは、細胞代謝、免疫応答、および組織リモデリングに関与する動的プロセスを理解するための強力なツールです。2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせることで、生体組織の重要な生化学的および生物物理学的情報を細胞内分解能で複数の視点から取得できます。具体的には、このデュアルモーダル顕微鏡は、神経変性疾患および脊髄損傷の進行を研究するために、マウス脊髄における細胞動態および相互作用を画像化するために使用することができる。
まず、キースイッチをスタンバイからオンの位置に切り替えてチタンサファイアレーザーの電源を入れ、レーザーがウォームアップするまで30分間待ちます。次に、OPOコントロールパネルのスタートボタンをクリックしてOPOの電源を入れ、レーザーがウォームアップするまで20分間待ちます。ピコ秒レーザーが暖まったら、ストークスビームのパワーを約20ミリワットに下げ、ストークスビーム用のレーザーシャッターを開き、OPO出力に高速フォトディテクタを配置してビームを検出することで、ストークスビームの変調深さを確認します。
次に、BNCコネクタ付きの同軸ケーブルを用いて、光検出器の出力ポートをオシロスコープの入力ポートに接続し、レーザパルスを監視します。次に、OPO制御ソフトウェアでEOM制御ウィンドウを開き、オシロスコープに示されているパルス強度図に従ってEOM電力と位相を調整して、20メガヘルツで最大変調深度を達成します。OPO制御ソフトウェアで、ストークス出力を停止しながらポンプレーザーシャッターを開きます。
次に、信号の設定ボックスをクリックしてポンプビームの波長を796ナノメートルに設定し、OPO電源ボックスを設定し、20を入力して光アライメントの電力を最小に設定します。次に、偏光ビームスプリッタの後ろにアライメント板P1を約10センチ、P1の後ろのプレートP2を光路上約30センチで配置する。ピコ秒レーザー光用の顕微鏡シャッターを開けた後、ミラーM1を調整して、ピコ秒レーザー光の中心をP1の貫通孔に位置させます。赤外線スコープを使用して、ミラーM1を調整するときにP1のビームスポットの位置を観察します。同様に、ミラーM2を調整して、ピコ秒レーザービームの中心をP2の貫通孔に位置させる。赤外線スコープを使用して、ミラーM2を調整するときにP2のビームスポットの位置を観察します。ピコ秒ビーム中心が両アライメントプレートの貫通孔に位置するまでミラーを調整した後、顕微鏡制御ソフトウェアでピコ秒ビームのシャッターを閉じる。
次に、フェムト秒レーザー光用の顕微鏡シャッターを開きます。ミラーM3を調整してP1の貫通穴にフェムト秒レーザー光スポット中心を配置し、次にミラーM4を調整してフェムト秒レーザー光スポット中心をP2の貫通穴に配置します。フェムト秒レーザー光の中心が2枚の配向板の貫通孔に位置するまでミラーを調整した後、フェムト秒ビーム用の顕微鏡シャッターを閉じる。次に、対物レンズの位置にカメラを配置して2つのビームスポットの位置を視覚化し、カメラ画面上のポンプビームの位置を基準としてマークします。
次に、レンズL3の前にアライメント板P0を配置し、ストークスビーム中心がレーザ出力ポートにおけるアライメントプレートの貫通孔を通過するように六角キーを用いて光学ミラー1を調整する。赤外線スコープを使用して、調整中のP0でのビームスポットの位置を確認します。次に、アライメントプレートP0を取り外し、六角キーを使用して光学ミラー2を調整し、ストークスビームの中心がカメラ上のポンプビームの基準マークと共局在するようにする。
ストークスビームがP0とカメラ面の両方でポンプビームと厳密に重なるまで、ミラーを調整し続けます。ロックインアンプ制御ソフトウェアを開き、ポンプレーザーの波長を796ナノメートルに設定し、ポンプとストークスビームのパワーをサンプルの15ミリワットと25ミリワットに対応する50ミリワットと70ミリワットに設定します。次に、ロックインアンプの位相最適化にオリーブオイルを使用します。
オリーブオイルは、信号の後方散乱またはEPI-SRS検出を強化するために、底部に取り付けられたティッシュペーパーでスライドに密封されます。オリーブオイルサンプルをステージに置き、サンプル上の25X対物レンズの焦点を調整します。顕微鏡制御ソフトウェアを使用して、テキスト原稿に記載されているようにイメージングパラメータを設定します。
次にロックインアンプ制御ソフトを用いて、時定数値を10マイクロ秒に設定する。次に、レーザービームをサンプル上でスキャンし、SRS信号強度が最大に達するまで22.5度のステップサイズで位相をチューニングします。次に、レーザーシャッターを閉じた状態でサンプルをスキャンし、平均SRS信号がゼロに近づくまでオフセット値を1ミリボルトのステップサイズで調整します。
次に、OPO制御ソフトウェアで遅延マネージャダイアログを開き、オリーブオイルをスキャンし、オリーブオイルSRS信号が最大に達するまで遅延ステージを調整します。次に、スキャンを停止し、遅延マネージャダイアログのデータの追加ボタンをクリックして、現在の遅延データを記録します。さまざまな化学サンプルをイメージングして、異なるラマンシフトで遅延データを同様に集録した後、遅延マネージャダイアログで5番目の順序でデータ適合を選択し、現在のデータポイントを5次ポリノミック関数で適合させます。
次に、カスタムとしての使用ボタンをクリックし、チェックボックスをオンにして、適合データを適用します。遅延段は、適合された遅延曲線に従って異なる波長で自動調整されます。in vivoイメージングの場合は、マウスを安定化ステージに固定し、脊髄を露出させ、生理食塩水に浸します。
次に、TPEF-SRS顕微鏡の下の5軸ステージに安定化ステージを取り付けます。次に、マウスヘッドを2つのヘッドバーで固定し、保持プレートを下げて、呼吸中の胸の動きに十分なスペースを確保し、モーションアーチファクトを軽減します。次に、Z並進段階を調整して、脊髄血管系のブライトフィールド画像が10倍の対物レンズの下で観察できるようになるまで焦点を調整します。
5軸段階の2軸並進段階を同調させることによって視野の中心にある脊髄背静脈を見つける。次に、5軸ステージのロール角とピッチ角を調整し、ブライトフィールド画像に基づいて対物軸に垂直な脊髄背面を調整します。次に、TPEF-SRSイメージング用の10Xを25X水浸漬対物レンズに置き換えます。
SRSイメージングの場合は、電動フリッパーに接続されているスイッチボタンを押して、対物レンズの上にある偏光ビームスプリッターを選択します。TPEFイメージングでは、電動フリッパーに接続されているスイッチボタンを押して、対物レンズの上にあるダイクロイックミラーD2を選択します。最後に、テキスト原稿の説明に従ってイメージングパラメータを設定し、サンプルのスキャンを開始します。
マウス脊髄内のまばらに標識されたYFP軸索およびミエリン鞘のインビボデュアルモーダルイメージングは、軸索がミエリン鞘の厚い層によって密接に包まれていることを明らかにした。TPEF-SRS脊髄画像に見られるように、ランヴィエの節は軸索径が小さく、腋窩は細胞外マトリックスに直接露出している。蛍光およびSRSイメージング用の新しいプローブと組み合わせることで、2光子励起蛍光SRS顕微鏡は、さまざまな生体分子の構造的および機能的イメージングを同時に実現し、複雑な生物学的プロセスの理解を容易にします。
