In Vivo, a imagem de tecidos biológicos com resolução subcelular e especificidade química é uma poderosa ferramenta para entender os processos dinâmicos envolvidos no metabolismo celular, resposta imune e remodelagem tecidual. Com fluorescência combinada de dois fótons e microscopia de dispersão raman estimulada, informações bioquímicas críticas e biofísicas de tecidos biológicos podem ser adquiridas a partir de múltiplas perspectivas com resolução subcelular. Especificamente, essa microscopia dual-modal pode ser usada para imagem da dinâmica celular e interações na medula espinhal do camundongo para estudar a progressão de doenças neurodegenerativas e lesão medular.
Para começar, ligue o laser de safira de titânio alternando o interruptor da chave da posição de espera para a posição e espere 30 minutos para o laser aquecer. Em seguida, ligue o OPO clicando no botão iniciar no painel de controle OPO e espere 20 minutos para que o laser aqueça. Após o laser picosegundo aquecido, verifique a profundidade de modulação do feixe de Stokes baixando a potência do feixe de Stokes para aproximadamente 20 miliwatts, abrindo o obturador laser para o feixe de Stokes e colocando um detector de fotos de alta velocidade na saída OPO para detectar o feixe.
Em seguida, conecte a porta de saída do fotodetetor à porta de entrada de um osciloscópio usando um cabo coaxial com um conector BNC para monitorar o pulso laser. Em seguida, abra a janela de controle EOM no software de controle OPO e ajuste a potência e a fase do EOM de acordo com o diagrama de intensidade de pulso mostrado no osciloscópio para alcançar a profundidade máxima de modulação em 20 mega-hertz. No software de controle OPO, abra o obturador a laser da bomba enquanto para a saída de Stokes.
Em seguida, clique na caixa de sinal de configuração para definir o comprimento de onda do feixe da bomba para 796 nanômetros, em seguida, clique na caixa de alimentação OPO definida e digite 20 para definir sua potência ao mínimo para alinhamento óptico. Em seguida, coloque a placa de alinhamento P1 atrás do divisor de feixe polarizador em cerca de 10 centímetros e coloque a placa P2 atrás de P1 a cerca de 30 centímetros no caminho óptico. Depois de abrir o obturador de microscópio para o feixe laser picosegundo, ajuste o espelho M1 para localizar o centro de raios laser picosegundo no buraco de P1. Use um escopo infravermelho para observar a posição do ponto de feixe em P1 ao ajustar o espelho M1. Da mesma forma, ajuste o espelho M2 para localizar o centro de raios laser picosegundo no buraco de P2. Use o escopo infravermelho para observar a posição do ponto de feixe em P2 ao ajustar o espelho M2. Depois de ajustar os espelhos até que o centro de feixe picosegundo se localize no orifício de ambas as placas de alinhamento, feche o obturador do feixe picosegundo no software de controle de microscópio.
Em seguida, abra o obturador de microscópio para o raio laser femtosegundo. Ajuste o espelho M3 para localizar o centro de ponto do feixe laser femtosegundo no buraco de P1, em seguida, ajuste o espelho M4 para localizar o centro de ponto do feixe laser femtosegundo no buraco de P2. Depois de ajustar os espelhos até que o centro de raios laser femtosegundo se localize nos orifícios das duas placas de alinhamento, feche o obturador de microscópio para o feixe femtosegundo. Em seguida, coloque uma câmera na posição do objetivo de visualizar a localização dos dois pontos de viga e marcar a posição do feixe da bomba na tela da câmera como referência.
Em seguida, coloque uma placa de alinhamento P0 antes da lente L3 e ajuste o espelho óptico usando uma tecla hexa, de modo que o centro de feixe stokes passe o orifício da placa de alinhamento na porta de saída laser. Use o escopo infravermelho para confirmar a posição do ponto de feixe em P0 durante o ajuste. Em seguida, remova a placa de alinhamento P0 e use a tecla hexax para ajustar o espelho óptico dois para que o centro do feixe stokes co-localize com a marca de referência do feixe de bomba na câmera.
Continue ajustando os espelhos até que o feixe de Stokes se sobreponha estritamente com o feixe da bomba tanto em P0 quanto nos aviões da câmera. Abra o software de controle do amplificador de travamento e defina o comprimento de onda do laser da bomba para 796 nanômetros e a potência da bomba e do feixe stokes para 50 e 70 miliwatts correspondentes a 15 e 25 miliwatts na amostra, respectivamente. Em seguida, use azeite para otimização de fase do amplificador de travamento.
O azeite é selado em um slide com papel de tecido preso ao fundo para melhorar a dispersão de sinal de volta ou detecção de EPI-SRS. Coloque a amostra de azeite no palco e ajuste o foco do objetivo 25X na amostra. Usando o software de controle de microscópio, defina os parâmetros de imagem mencionados no manuscrito do texto.
Em seguida, usando o software de controle do amplificador lock-in, defina o valor constante de tempo para 10 microsegundos. Em seguida, escaneie o raio laser sobre a amostra, afinando a fase com um tamanho de passo de 22,5 graus até que a intensidade do sinal SRS atinja o máximo. Em seguida, escaneie a amostra com o obturador a laser fechado, ajustando o valor de deslocamento com um tamanho de passo de um milívolo até que o sinal srs médio esteja perto de zero.
Em seguida, abra o diálogo do gerenciador de atrasos no software de controle OPO e escaneie o azeite de oliva, afinando a etapa de atraso até que o sinal SRS de azeite atinja seu máximo. Em seguida, pare de digitalizar e clique no botão adicionar dados na caixa de diálogo do gerenciador de atraso para registrar os dados de atraso atuais. Depois de adquirir dados de atraso em diferentes mudanças raman por imagem várias amostras químicas, selecione os dados que se encaixam na ordem cinco na caixa de diálogo do gerente de atraso para se encaixar nos pontos de dados atuais com a função polinómica de quinta ordem.
Em seguida, aplique os dados instalados clicando no uso como botão personalizado e verificando a caixa de seleção. O estágio de atraso é ajustado automaticamente em diferentes comprimentos de onda de acordo com a curva de atraso instalada. Para imagens in vivo, fixar o mouse em estágio de estabilização com sua medula espinhal exposta e imersa em soro fisiológico.
Agora monte o estágio de estabilização em um estágio de cinco eixos abaixo do microscópio TPEF-SRS. Em seguida, fixe a cabeça do mouse com duas barras de cabeça e baixe a placa de retenção para oferecer espaço suficiente para o movimento do peito durante a respiração, aliviando artefatos de movimento. Em seguida, ajuste o estágio Z-translacional para ajustar o foco até que a imagem brightfield da vasculatura da medula espinhal possa ser observada sob um objetivo de 10X.
Localize a veia dorsal da medula espinhal no centro do campo de visão, afinando o estágio translacional de dois eixos do estágio de cinco eixos. Em seguida, sintonize os ângulos de rolo e tom do estágio de cinco eixos para ajustar a superfície dorsal da medula espinhal perpendicular ao eixo objetivo com base na imagem brightfield. Em seguida, substitua o 10X por um objetivo de imersão de água de 25X para imagens TPEF-SRS.
Para a imagem SRS, selecione o divisor de feixes polarizadores acima do objetivo pressionando o botão de interruptor conectado à nadadeira motorizada. Para a imagem TPEF, selecione o espelho dicroico D2 acima do objetivo pressionando o botão de interruptor conectado à nadadeira motorizada. Por fim, defina os parâmetros de imagem conforme descrito no manuscrito do texto e comece a digitalizar a amostra.
Imagens de dois modais in vivo de axônios YFP e baás de mielina na medula espinhal do rato revelaram que os axônios são intimamente envoltos por uma camada grossa de baás de mielina. Como pode ser visto na imagem da medula espinhal TPEF-SRS, os nós de Ranvier diminuíram o diâmetro axonal e o axilemma está diretamente exposto à matriz extracelular. Combinado com novas sondas para fluorescência e ressonância magnética de dois fótons exultantes da microscopia SRS pode alcançar imagens estruturais e funcionais simultâneas de várias biomoléculas, facilitando nossa compreensão de processos biológicos complexos.
