פרוטוקול זה משפר במידה ניכרת את הניגודיות בין רקמות הצמח הטפילי לבין המארח בדגימות שינותחו באמצעות מיקרוטומוגרפיה. הטכניקה המתוארת כאן מאיצה את תהליך זילוח הניגוד דרך הדגימה, ומאפשרת ניתוח של רקמות ומבנים ספציפיים שנוצרו בין הצמח הטפילי לבין הפונדקאי. גישת הוואקום פשוטה מאוד ולא אמורה להציע קשיים.
מנגנון הזילוח, לעומת זאת, עשוי להיות מעט מאתגר להתקנה. אבל תרגול מראש יכול לעזור. עבור דגימות קטנות שאינן עציות, ניתן להשתמש בשיטת ואקום ליישום.
ואילו שיטת השפע צריכה לשמש לדגימות גדולות ועציות, כולל קטע של הגבעול או השורש הפונדקאי. אם אתם משתמשים בשיטת ואקום, הניחו את הדגימה בבקבוקון המכיל את תמיסת הניגוד. לאחר מכן, הניחו את הבקבוקון בתא ואקום או מייבש המחובר למשאבת ואקום.
הסירו את המכסה מהבקבוקון וסגרו את תא הוואקום או המייבש. בדקו שאין סדקים בתא הוואקום או במייבש. פתח את שסתום התשישות של החדר או מייבש כדי לדחוף את האוויר החוצה.
הפעל את המשאבה והמתן עד שהלחץ יגיע לכ -20 אינץ 'כספית, או 10 psi. סגור את התא או את שסתום הפליטה של מייבש האוויר כדי למנוע כניסת אוויר מחדש. לאחר מכן כבה במהירות את המשאבה.
השאירו את הדגימה תחת ואקום למשך שעתיים לפחות. אם אתה משתמש בשיטת השפע, בחר את מיכל האספקה בהתאם לגודל המדגם. עבור דגימות קטנות, מזרק 50 מיליליטר ללא מחט יכול לשמש טנק.
חבר קצה אחד של צינור פלסטיק שקוף למיכל האספקה. לאחר מכן חבר את הקצה השני לשסתום דו-כיווני או תלת-כיווני. חבר צינור שני לשקע אחר בשסתום.
אבטח את מיכל האספקה במיקום מוגבה מבלי לפרק את המנגנון שהוקם בשלב הקודם. סגור את השסתום התלת-כיווני או הדו-כיווני כדי למנוע יציאת נוזלים ממערכת הצינורות, ושפך את התמיסה המנוגדת למיכל האספקה. ודא שאין בועות אוויר גדולות במערכת הצינורות וסגור שוב את השסתום, תוך השארת המכשיר במקומו.
כדי להכין את הדגימה לשפע של תמיסת הניגוד, שמור אותה שקועה בנוזל וחתך את קצה הקצה הפרוקסימלי של הגבעול או השורש המארח. פתח בזהירות את השסתום כדי לאפשר לתמיסת הניגוד לזרום לאט ומלא את צינורות הפלסטיק המחוברים למיכל תוך החזקת הקצה הפתוח של המערכת במיקום מוגבה מעט כדי למנוע את שפיכת התמיסה המנוגדת. חבר את הקצה הפרוקסימלי של הגבעול או השורש המארח בדגימה לקצה הפתוח של מערכת הצינורות.
תנו לתמיסה לחורר את הדגימה במשך שעתיים לפחות או עד שהתמיסה מצטברת בתוך המיכל. סגור את השסתום ונתק בזהירות את הדגימה מהמנגנון. שטפו את הדגימה על ידי טבילתה במים למשך שתי דקות.
הניחו את הדגימה במגבת נייר בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לעודפי המים להתאדות למשך שתיים עד חמש דקות מבלי לאפשר לדגימה להתייבש לחלוטין. עטפו את הדגימה בסרט פרפין והימנעו מקיפול הסרט על גבי הדגימה. ניתן למנף סריקת מיקרו-CT כדי להבין טוב יותר את המבנים המורכבים של צמחים טפיליים ואת האינטראקציה שלהם עם פונדקאים בדרך תלת-ממדית לא הרסנית.
הפרוטוקולים המתוארים כאן פועלים עבור מערכות מיקרו-CT שונות. עם זאת, ההגדרות והפרמטרים תלויים במערכת ובדגימות. תמונות תלת-ממדיות של מיקרוסקופ רנטגן היו יעילות כמו מקטעים אנטומיים שנצפו במיקרוסקופ אור כדי לנתח את ארגון הרקמה והטופולוגיה בממשק הפונדקאי של הטפיל.
בהתבסס על הבדלי הצבעים הלבנים והאפורים הכהים עקב ספיגה דיפרנציאלית של תמיסת הניגוד, ניתן להבחין בשפע הפרנכימה המקיפה את ליבת כלי הדם של האוסטוריום. ליבת כלי הדם נצפית בקלות בחתכים מכיוון ששני גדילי כלי דם מופרדים על ידי פרנכימה. האנדופרזיט Viscum minimum, שגדל בתוך צמח פונדקאי עסיסי, הראה תאי פרנכימה המאחסנים פחמימות בצורה של עמילן.
ההבדל בספיגת היוד איפשר לזהות את הרשת המורכבת של גדילי קליפת המוח שנוצרו על ידי האנדופרזיט בתוך הגוף המארח. התוצאות שהתקבלו עבור Cuscuta Americana ו- Struthantus marcianus עוזרות להמחיש את הנוחות של גישת המיקרוטומוגרפיה עבור דגימות קטנות וגדולות בהתאמה. החתך הסדרתי הווירטואלי של פטריות סיבליום הראה כי כלי הדם בשורש הפונדקאי מתפצלים לפקעת הטפיל, וכי רצף הקסילם בין שני הצמחים נוצר על ידי חיבור כלי לכלי באמצעות לוחות ניקוב.
ניתן לשלב את ההליך המתואר כאן עם טכניקות אחרות, כגון סגמנטציה וירטואלית, כדי לספק תובנות חדשות על המבנה התלת-ממדי של הקשר בין צמחים טפיליים לפונדקאים שלהם. טכניקה זו סללה את הדרך לניתוח היבטים שונים של הביולוגיה של צמחים טפיליים, כולל פיתוח אנדופרזיטים ופונקציונליות של קשרים היפר-טפיליים.
