Этот протокол значительно улучшает контраст между тканями растения-паразита и хозяина в образцах, которые будут проанализированы с помощью микротомографии. Описанный здесь метод ускоряет процесс перфузии контраста через образец, позволяя анализировать конкретные ткани и структуры, образующиеся между паразитическим растением и хозяином. Вакуумный подход очень прост и не должен вызывать трудностей.
С другой стороны, перфузионный аппарат может быть немного сложным в настройке. Но предварительная практика может помочь. Для небольших недревесных образцов можно использовать вакуумный метод.
Принимая во внимание, что метод изобилия следует использовать для образцов, которые являются более крупными и древесными, включая сегмент стебля хозяина или корня. При использовании вакуумного метода поместите образец во флакон с контрастным раствором. Затем поместите флакон в вакуумную камеру или эксикатор, подключенный к вакуумному насосу.
Снимите крышку с флакона и закройте вакуумную камеру или эксикатор. Убедитесь, что на вакуумной камере или эксикаторе нет трещин. Откройте выпускной клапан камеры или эксикатора, чтобы вытеснить воздух.
Включите насос и подождите, пока давление не достигнет примерно 20 дюймов ртутного столба или 10 фунтов на квадратный дюйм. Закройте камеру или выпускной клапан эксикатора, чтобы предотвратить повторное попадание воздуха. Затем быстро выключите насос.
Оставьте образец под вакуумом не менее чем на два часа. Если вы используете метод изобилия, выберите подающий резервуар в соответствии с размером образца. Для небольших образцов в качестве бака можно использовать шприц объемом 50 миллилитров без иглы.
Подсоедините один конец прозрачной пластиковой трубки к подающему баку. Затем подсоедините другой конец к двухходовому или трехходовому клапану. Подсоедините вторую трубку к другому выходному отверстию клапана.
Закрепите резервуар подачи на возвышении, не разбирая устройство, установленное на предыдущем шаге. Закройте трехходовой или двухходовой клапан, чтобы предотвратить выход жидкости из системы трубок, и залейте контрастный раствор в подающий бак. Убедитесь, что в системе трубок нет больших пузырьков воздуха, и снова закройте клапан, оставив аппарат на месте.
Чтобы подготовить образец к обильному введению контрастного раствора, держите его погруженным в жидкость и отрежьте кончик проксимального конца стебля или корня хозяина. Осторожно откройте клапан, чтобы контрастный раствор протекал медленно, и заполните пластиковую трубку, соединенную с резервуаром, удерживая открытый конец системы в слегка приподнятом положении, чтобы предотвратить разлив контрастного раствора. Подсоедините проксимальный конец основного стебля или корня в образце с открытым концом системы трубок.
Дайте раствору перфузировать образец в течение не менее двух часов или до тех пор, пока раствор не накопится внутри контейнера. Закройте клапан и осторожно отсоедините образец от аппарата. Промойте образец, погрузив его в воду на две минуты.
Поместите образец в бумажное полотенце комнатной температуры, чтобы лишняя вода испарилась в течение двух-пяти минут, не позволяя образцу полностью высохнуть. Заверните образец в парафиновую пленку и не сворачивайте пленку поверх образца. Микро-КТ-сканирование может быть использовано для лучшего понимания сложных структур паразитических растений и их взаимодействия с хозяевами неразрушающим, трехмерным способом.
Описанные здесь протоколы работают для различных систем микро-КТ. Однако настройки и параметры зависят от системы и образцов. Изображения 3D-рентгеновского микроскопа были столь же эффективны, как и анатомические срезы, наблюдаемые под световым микроскопом, для анализа организации и топологии тканей на интерфейсе хозяина паразита.
Исходя из ярко-белой и темно-серой цветовой разницы из-за дифференциального поглощения контрастного раствора, можно наблюдать обилие паренхимы, окружающей сосудистое ядро гаустория. Сосудистое ядро легко наблюдать в поперечных сечениях, так как две сосудистые нити разделены паренхимой. Эндопаразит Viscum minimum, растущий внутри суккулентного растения-хозяина, показал клетки паренхимы, которые хранят углеводы в виде крахмала.
Разница в поглощении йода позволила обнаружить сложную сеть корковых нитей, образованных эндопаразитом в организме хозяина. Результаты, полученные для Cuscuta Americana и Struthantus marcianus, помогают проиллюстрировать удобство подхода к микротомографии для малых и больших образцов соответственно. Виртуальное серийное секционирование Sibelium fungiform показало, что сосуды в корне хозяина раздваиваются на клубень паразита, и что непрерывность ксилемы между двумя растениями образована соединением сосуда с сосудом через перфорационные пластины.
Описанная здесь процедура может быть объединена с другими методами, такими как виртуальная сегментация, чтобы дать новое представление о трехмерной структуре связи между паразитическими растениями и их хозяевами. Этот метод проложил путь к анализу различных аспектов биологии паразитических растений, включая развитие эндопаразитов и функциональность гиперпаразитарных связей.
