Este protocolo melhora consideravelmente o contraste entre os tecidos da planta parasita e do hospedeiro nas amostras que serão analisadas por microtomografia. A técnica aqui descrita acelera o processo de perfusão do contraste através da amostra, permitindo a análise de tecidos e estruturas específicas formadas entre a planta parasita e o hospedeiro. A abordagem do vácuo é muito simples e não deve oferecer dificuldades.
O aparelho de perfusão, por outro lado, pode ser um pouco difícil de montar. Mas a prática antecipada pode ajudar. Para pequenas amostras não lenhosas, o método de vácuo pode ser usado para aplicação.
Já o método de profusão deve ser utilizado para amostras maiores e lenhosas, incluindo um segmento do caule ou raiz do hospedeiro. Se utilizar o método a vácuo, colocar a amostra no frasco para injetáveis que contém a solução contrastante. Em seguida, coloque o frasco para injetáveis numa câmara de vácuo ou exsicador ligado a uma bomba de vácuo.
Retire a tampa do frasco para injetáveis e feche a câmara de vácuo ou o dessecador. Verifique se não há rachaduras na câmara de vácuo ou no dessecador. Abra a válvula de exaustão da câmara ou exsicador para forçar a saída de ar.
Ligue a bomba e aguarde até que a pressão atinja aproximadamente 20 polegadas de mercúrio, ou 10 psi. Feche a câmara ou a válvula de escape do exsicador para evitar a reentrada de ar. Em seguida, desligue rapidamente a bomba.
Deixe a amostra sob vácuo por pelo menos duas horas. Se estiver usando o método de profusão, selecione o tanque de alimentação de acordo com o tamanho da amostra. Para amostras pequenas, uma seringa de 50 mililitros sem agulha pode ser usada como tanque.
Conecte uma extremidade de uma tubulação de plástico transparente ao tanque de alimentação. Em seguida, conecte a outra extremidade a uma válvula bidirecional ou tridirecional. Conecte uma segunda tubulação a uma saída diferente na válvula.
Fixe o tanque de alimentação em uma posição elevada sem desmontar o aparelho configurado na etapa anterior. Feche a válvula de três ou duas vias para evitar que o líquido saia do sistema de tubulação e despeje a solução contrastante no tanque de alimentação. Certifique-se de que não há grandes bolhas de ar no sistema de tubulação e feche a válvula novamente, deixando o aparelho no lugar.
Para preparar a amostra para profusão da solução de contraste, mantê-la submersa em líquido e cortar a ponta da extremidade proximal do caule ou raiz do hospedeiro. Abra cuidadosamente a válvula para permitir que a solução contrastante flua lentamente e encha a tubulação plástica conectada ao tanque, mantendo a extremidade aberta do sistema em uma posição ligeiramente elevada para evitar que a solução contrastante vaze. Conecte a extremidade proximal do caule ou raiz hospedeira na amostra à extremidade aberta do sistema de tubulação.
Deixar a solução perfundir a amostra durante, pelo menos, duas horas ou até que a solução se acumule no interior do recipiente. Feche a válvula e desconecte cuidadosamente a amostra do aparelho. Lave a amostra submergindo-a em água durante dois minutos.
Coloque a amostra num papel toalha à temperatura ambiente para permitir que o excesso de água evapore durante dois a cinco minutos sem permitir que a amostra seque completamente. Embrulhe a amostra em uma película de parafina e evite dobrá-la em cima da amostra. A micro-TC pode ser aproveitada para entender melhor as estruturas complexas de plantas parasitas e sua interação com hospedeiros de forma não destrutiva e tridimensional.
Os protocolos aqui descritos funcionam para diferentes sistemas de micro-TC. No entanto, as configurações e parâmetros dependem do sistema e das amostras. Imagens de microscópio de raios X 3D foram tão eficazes quanto cortes anatômicos observados sob microscópio de luz para analisar a organização e topologia do tecido na interface parasita hospedeiro.
Com base na diferença de cor branco brilhante e cinza escuro devido à absorção diferencial da solução de contraste, é possível observar a abundância de parênquima ao redor do núcleo vascular do haustório. O núcleo vascular é facilmente observado em cortes transversais, pois duas fitas vasculares são separadas por parênquima. O endoparasita Viscum minimum, crescendo dentro de uma suculenta planta hospedeira, apresentou células parenquimáticas que armazenam carboidratos na forma de amido.
A diferença na absorção de iodo permitiu a detecção da intrincada teia de cordões corticais formados pelo endoparasita dentro do corpo do hospedeiro. Os resultados obtidos para Cuscuta Americana e Struthantus marcianus ajudam a ilustrar a conveniência da abordagem microtomográfica para amostras pequenas e maiores, respectivamente. O corte seriado virtual do fungiforme Sibelium mostrou que os vasos da raiz do hospedeiro se bifurcam no tubérculo do parasita, e que a continuidade do xilema entre as duas plantas é formada pela conexão vaso-vaso através de placas de perfuração.
O procedimento aqui descrito pode ser combinado com outras técnicas, como a segmentação virtual, para fornecer novos insights sobre a estrutura tridimensional da conexão entre plantas parasitas e seus hospedeiros. Esta técnica abriu caminho para a análise de diferentes aspectos da biologia de plantas parasitas, incluindo o desenvolvimento de endoparasitas e a funcionalidade de conexões hiperparasitárias.
