Bu protokol, mikrotomografi kullanılarak analiz edilecek örneklerde parazitik bitkinin dokuları ile konakçı arasındaki kontrastı önemli ölçüde artırır. Burada tarif edilen teknik, numune boyunca kontrast perfüzyon sürecini hızlandırır ve parazitik bitki ile konakçı arasında oluşan spesifik dokuların ve yapıların analizine izin verir. Vakum yaklaşımı çok basittir ve hiçbir zorluk sunmamalıdır.
Öte yandan, perfüzyon aparatının kurulumu biraz zor olabilir. Ancak önceden pratik yapmak yardımcı olabilir. Odunsu olmayan küçük numuneler için, uygulama için vakum yöntemi kullanılabilir.
Oysa profüzyon yöntemi, konakçı sapının veya kökün bir segmenti de dahil olmak üzere daha büyük ve odunsu numuneler için kullanılmalıdır. Vakum yöntemini kullanıyorsanız, numuneyi zıt çözeltiyi içeren şişeye yerleştirin. Ardından, şişeyi bir vakum pompasına bağlı bir vakum odasına veya kurutucuya yerleştirin.
Kapağı şişeden çıkarın ve vakum odasını veya kurutucuyu kapatın. Vakum odasında veya kurutucuda çatlak olmadığını kontrol edin. Havayı dışarı çıkmaya zorlamak için haznenin veya kurutucunun egzoz valfini açın.
Pompayı açın ve basınç yaklaşık 20 inç cıva veya 10 psi'ye ulaşana kadar bekleyin. Havanın tekrar girmesini önlemek için hazneyi veya kurutucu egzoz valfini kapatın. Ardından pompayı hızla kapatın.
Numuneyi en az iki saat vakum altında bırakın. Profüzyon yöntemini kullanıyorsanız, besleme tankını numune boyutuna göre seçin. Küçük numuneler için, iğnesiz 50 mililitrelik bir şırınga tank olarak kullanılabilir.
Şeffaf bir plastik borunun bir ucunu besleme tankına bağlayın. Ardından diğer ucunu iki yönlü veya üç bir valfe bağlayın. İkinci bir boruyu valfteki farklı bir prize bağlayın.
Önceki adımda kurulan aparatı sökmeden besleme tankını yüksek bir konumda sabitleyin. Sıvının boru sisteminden çıkmasını önlemek için üç yönlü veya iki yönlü valfi kapatın ve kontrast çözeltiyi besleme tankına dökün. Boru sisteminde büyük hava kabarcıkları olmadığından emin olun ve aparatı yerinde bırakarak vanayı tekrar kapatın.
Numuneyi kontrast çözeltisinin bolluğuna hazırlamak için, sıvıya batırılmış halde tutun ve konakçı sapının veya kökün proksimal ucunun ucunu kesin. Zıt çözeltinin yavaşça akmasına izin vermek için vanayı dikkatlice açın ve zıt çözeltinin dökülmesini önlemek için sistemin açık ucunu hafifçe yükseltilmiş bir konumda tutarken tanka bağlı plastik boruyu doldurun. Numunedeki konakçı gövdenin veya kökün proksimal ucunu boru sisteminin açık ucuna bağlayın.
Çözeltinin numuneyi en az iki saat boyunca veya çözelti kabın içinde birikinceye kadar perfüze etmesine izin verin. Vanayı kapatın ve numuneyi cihazdan dikkatlice ayırın. Numuneyi iki dakika suya batırarak yıkayın.
Numunenin tamamen kurumasına izin vermeden fazla suyun iki ila beş dakika buharlaşmasını sağlamak için numuneyi oda sıcaklığında bir kağıt havluya koyun. Numuneyi bir parafin filme sarın ve filmi numunenin üzerine katlamaktan kaçının. Mikro-BT taraması, parazitik bitkilerin karmaşık yapılarını ve konakçılarla etkileşimlerini tahribatsız, üç boyutlu bir şekilde daha iyi anlamak için kullanılabilir.
Burada açıklanan protokoller farklı mikro-BT sistemleri için çalışır. Ancak, ayarlar ve parametreler sisteme ve örneklere bağlıdır. 3D X-ışını mikroskobu görüntüleri, parazit konakçı arayüzünde doku organizasyonunu ve topolojiyi analiz etmek için ışık mikroskobu altında gözlemlenen anatomik kesitler kadar etkiliydi.
Kontrast çözeltisinin diferansiyel emilimine bağlı parlak beyaz ve koyu gri renk farkına dayanarak, haustoriumun vasküler çekirdeğini çevreleyen parankimin bolluğunu gözlemlemek mümkündür. İki vasküler iplikçik parankim ile ayrıldığı için vasküler çekirdek enine kesitlerde kolayca gözlenir. Etli bir konakçı bitkinin içinde büyüyen endoparazit Viscum minimum, karbonhidratları nişasta şeklinde depolayan parankim hücrelerini gösterdi.
İyot emilimindeki fark, konakçı vücuttaki endoparazit tarafından oluşturulan karmaşık kortikal iplikçik ağının tespit edilmesine izin verdi. Cuscuta Americana ve Struthantus marcianus için elde edilen sonuçlar, sırasıyla küçük ve büyük örnekler için mikrotomografi yaklaşımının rahatlığını göstermeye yardımcı olmaktadır. Sanal seri kesitleme Sibelium fungiform, konakçı kökündeki damarların parazit yumrusuna çatallandığını ve iki bitki arasındaki ksilem sürekliliğinin perforasyon plakaları aracılığıyla damardan damara bağlantı ile oluştuğunu göstermiştir.
Burada açıklanan prosedür, parazitik bitkiler ve konakçıları arasındaki bağlantının üç boyutlu yapısına yeni bakış açıları sağlamak için sanal segmentasyon gibi diğer tekniklerle birleştirilebilir. Bu teknik, endoparazitlerin gelişimi ve hiperparaziter bağlantıların işlevselliği de dahil olmak üzere parazitik bitkilerin biyolojisinin farklı yönlerini analiz etmenin yolunu açmıştır.
