Dieses Protokoll verbessert den Kontrast zwischen dem Gewebe der parasitären Pflanze und dem Wirt in Proben, die mit Hilfe der Mikrotomographie analysiert werden, erheblich. Die hier beschriebene Technik beschleunigt den Prozess der Kontrastmittelperfusion durch die Probe und ermöglicht die Analyse spezifischer Gewebe und Strukturen, die zwischen der parasitären Pflanze und dem Wirt gebildet werden. Der Vakuumansatz ist sehr einfach und sollte keine Schwierigkeiten bereiten.
Der Perfusionsapparat hingegen kann etwas schwierig einzurichten sein. Aber Übung im Vorfeld könnte helfen. Für kleine, nicht holzige Proben kann die Vakuummethode zur Anwendung verwendet werden.
Die Schmelzmethode sollte hingegen für Proben verwendet werden, die größer und holzig sind, einschließlich eines Segments des Wirtsstamms oder der Wurzel. Wenn Sie die Vakuummethode anwenden, legen Sie die Probe in die Durchstechflasche mit der kontrastierenden Lösung. Stellen Sie dann die Durchstechflasche in eine Vakuumkammer oder einen Exsikkator, der an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist.
Entfernen Sie den Deckel von der Durchstechflasche und schließen Sie die Vakuumkammer oder den Exsikkator. Stellen Sie sicher, dass die Vakuumkammer oder der Exsikkator keine Risse aufweisen. Öffnen Sie das Abluftventil der Kammer oder des Exsikkators, um die Luft herauszudrücken.
Schalten Sie die Pumpe ein und warten Sie, bis der Druck ungefähr 20 Zoll Quecksilber oder 10 psi erreicht. Schließen Sie die Kammer oder das Auslassventil des Exsikkators, um ein erneutes Eindringen von Luft zu verhindern. Schalten Sie dann schnell die Pumpe aus.
Lassen Sie die Probe mindestens zwei Stunden lang unter Vakuum. Wenn Sie die Füllmethode verwenden, wählen Sie den Vorratsbehälter entsprechend der Stichprobengröße aus. Für kleine Proben kann eine 50-Milliliter-Spritze ohne Nadel als Tank verwendet werden.
Verbinden Sie ein Ende eines transparenten Kunststoffschlauchs mit dem Vorratstank. Schließen Sie dann das andere Ende an ein Zweiwege- oder Dreiwegeventil an. Schließen Sie einen zweiten Schlauch an einen anderen Auslass im Ventil an.
Befestigen Sie den Vorratsbehälter an einer erhöhten Position, ohne das im vorherigen Schritt eingerichtete Gerät zu zerlegen. Schließen Sie das Dreiwege- oder Zweiwegeventil, um zu verhindern, dass Flüssigkeit aus dem Schlauchsystem austritt, und gießen Sie die kontrastierende Lösung in den Vorratstank. Stellen Sie sicher, dass sich keine großen Luftblasen im Schlauchsystem befinden, und schließen Sie das Ventil wieder, während Sie das Gerät an Ort und Stelle lassen.
Um die Probe für die Fülle der Kontrastlösung vorzubereiten, tauchen Sie sie in Flüssigkeit und schneiden Sie die Spitze des proximalen Endes des Wirtsstamms oder der Wurzel ab. Öffnen Sie vorsichtig das Ventil, damit die kontrastierende Lösung langsam fließen kann, und füllen Sie den mit dem Tank verbundenen Kunststoffschlauch, während Sie das offene Ende des Systems in einer leicht erhöhten Position halten, um ein Verschütten der kontrastierenden Lösung zu verhindern. Verbinden Sie das proximale Ende des Wirtsstamms oder der Wurzel in der Probe mit dem offenen Ende des Schlauchsystems.
Lassen Sie die Lösung die Probe mindestens zwei Stunden lang durchbluten oder bis sich die Lösung im Behälter ansammelt. Schließen Sie das Ventil und trennen Sie die Probe vorsichtig vom Gerät. Waschen Sie die Probe, indem Sie sie zwei Minuten lang in Wasser tauchen.
Legen Sie die Probe bei Raumtemperatur in ein Papiertuch, damit überschüssiges Wasser zwei bis fünf Minuten lang verdunsten kann, ohne dass die Probe vollständig austrocknet. Wickeln Sie die Probe in eine Paraffinfolie ein und vermeiden Sie es, die Folie auf die Probe zu falten. Mikro-CT-Scans können genutzt werden, um die komplexen Strukturen parasitärer Pflanzen und ihre Interaktion mit Wirten auf zerstörungsfreie, dreidimensionale Weise besser zu verstehen.
Die hier beschriebenen Protokolle funktionieren für verschiedene Mikro-CT-Systeme. Die Einstellungen und Parameter hängen jedoch vom System und den Proben ab. 3D-Röntgenmikroskopaufnahmen waren genauso effektiv wie anatomische Schnitte, die unter einem Lichtmikroskop beobachtet wurden, um die Gewebeorganisation und -topologie an der Grenzfläche des Parasitenwirts zu analysieren.
Anhand des hellweißen und dunkelgrauen Farbunterschieds aufgrund der unterschiedlichen Absorption der Kontrastlösung ist es möglich, die Häufigkeit von Parenchymen zu beobachten, die den vaskulären Kern des Haustoriums umgeben. Der Gefäßkern ist in Querschnitten leicht zu erkennen, da zwei Gefäßstränge durch ein Parenchym getrennt sind. Der Endoparasit Viscum minimum, der in einer sukkulenten Wirtspflanze wächst, zeigte Parenchymzellen, die Kohlenhydrate in Form von Stärke speichern.
Der Unterschied in der Jodaufnahme ermöglichte den Nachweis des komplizierten Netzes kortikaler Stränge, das vom Endoparasiten im Wirtskörper gebildet wird. Die Ergebnisse für Cuscuta Americana und Struthantus marcianus verdeutlichen die Zweckmäßigkeit des Mikrotomographie-Ansatzes für kleine bzw. größere Proben. Die virtuelle Serienschnittung der Sibelium-Pilzform zeigte, dass sich die Gefäße in der Wirtswurzel in die Parasitenknolle gabeln und dass die Xylemkontinuität zwischen den beiden Pflanzen durch die Verbindung von Gefäß zu Gefäß über Perforationsplatten gebildet wird.
Das hier beschriebene Verfahren kann mit anderen Techniken, wie z.B. der virtuellen Segmentierung, kombiniert werden, um neue Einblicke in die dreidimensionale Struktur der Verbindung zwischen parasitären Pflanzen und ihren Wirten zu erhalten. Diese Technik hat den Weg für die Analyse verschiedener Aspekte der Biologie parasitärer Pflanzen geebnet, einschließlich der Entwicklung von Endoparasiten und der Funktionalität hyperparasitischer Verbindungen.
