בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

הפרוטוקול מאפשר לנו לזהות את השפעת הטיפול על הרגישות למלריה של וקטורים למלריה אפריקאית. לדוגמה, תרכובות שמטרתן לחסום את ההעברה מהאדם ליתוש. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להעריך מספר רב של תרכובות בתנאי מעבדה, עוד לפני ש-GATEs רעילים זמינים.

נתיחות מידגוט יכולות להיות מאתגרות בהתחלה, אבל זה פשוט דורש קצת תרגול. כמו כן, כדי להיות מסוגל לזהות oocysts לא תמיד קל. ראשית, באמצעות שואב פה, הכניסו 25 יתושי Anopheles gambiae נקבות לא מזוהמות לכוס האכלה של 350 מיליליטר.

יש לסמן את הכוסות בצורה ברורה כדי להבחין בין קבוצת הביקורת לבין קבוצות הטיפול. בחר את מספר הכוסות לכל טיפול בהתאם למספר המשכפלים הטכניים הכלולים. חבר את מערכת הזנת הזכוכית לאמבטיית מים ושמור על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הכינו את המעי של הפרה או את הממברנה הסינתטית על ידי שטיפתה במי ברז וחתכתם לחתיכות המותאמות לכל מזין. מכסים את החלק התחתון של כל מזין ומהדקים את הממברנה עם רצועה אלסטית. לשימוש בכוסות ההזנה ככוסות זיהום, ראשית, יש לשמור את הממברנה על גבי רשתות הכוסות.

לאחר מכן הניחו את כוסות הזיהום מתחת למאכילים. כעת, הוסף מיליליטר אחד של דם נגוע בגמטוציטים למזיני כוסות הבקרה, ודם נגוע בגמטוציטים עם תרכובת בדיקה למזיני כוסות הטיפול. ואז להשאיר את היתושים להאכיל במשך כ 40 דקות.

לאחר ההאכלה, להסיר את המזינים מן הכוסות, לשטוף את המאכילים, ולטפל הדם עודף עם hypochlorite. לאחר מכן, הפילו את כל היתושים על הקרח למשך דקה עד שתיים, ובחרו את היתושים שלקחו ארוחת דם על ידי חיפוש בטן נפוחה ואדומה. החליפו את מי הסוכר הניתנים בימים חלופיים לכל זיהום בפד מים של 10% סוכר, ודגרו את כוסות הזיהום בתא בטיחות ביולוגית למשך שמונה עד עשרה ימים.

שמונה עד עשרה ימים לאחר ההאכלה, הפילו את היתושים הנגועים על ידי הנחתם על קרח. לאחר מכן, העבר אותם לצינורות מסומנים עם 70% אתנול, תוך שמירה על שליטה בכל קבוצת טיפול בצינורות נפרדים. תוך שמירה על הפרדה בין קבוצות הבקרה והבדיקה, העבירו את היתושים לצלחות פטרי מסומנות מרופדות בנייר סינון.

הוסיפו טיפה של PBS על מגלשת זכוכית המסומנת כראוי, והעבירו יתוש מנייר הסינון אל הטיפה. להצמיד את בית החזה של היתוש עם מחט לנתח. לאחר מכן, הסר את midgut על ידי משיכת קטע הבטן השביעי עם מלקחיים, ולהעביר אותו טיפה של 0.1% mercurochrome על שקופית מיקרוסקופ חדש.

השאירו את המעיים להכתים במשך שמונה עד 10 דקות. לאחר מכן הניחו כיסוי על המעיים המוכתמים, וצפו בו תחת תאורת שדה בהירה בהגדלה של פי 20 עד 40. רשום את מספר oocysts לכל midgut עבור הבקרה וכל קבוצת טיפול.

במחקר זה, התרכובת MMV1581558 נמצאה כמגבילה באופן משמעותי את מספר הפלסמודיום falciparum oocysts באמצע היתושים של נקבות אנופלס גמביה בהשוואה לבקרה. בקבוצת הביקורת, השכיחות הממוצעת של oocysts במידגוט הייתה 89% עם עוצמה ממוצעת של 9.5 oocysts לכל midgut. אבל בקבוצה שטופלה ב-MMV1581558, השכיחות הממוצעת של oocysts הייתה 36% עם עוצמה ממוצעת של 1.5 oocysts בלבד לכל midgut.

לפיכך, טיפול MMV1581558 הביא לפעילות חסימת שידור של 58% והפחתה של 82% בפעילות בכל שלושת המשכפלים הביולוגיים. זה קריטי כדי להבטיח כי יתושים להאכיל על תרבית gametocyte בריא. אם אלה הם גמטוציטים לא בשלים, או לא שלב חמש gametocytes, ההסתברות לקבל זיהום יתוש הוא מוגבל או בלתי אפשרי.

הבדיקה משתמשת בשיטת זיהוי מורפולוגית חזותית, אולם ניתן להשתמש במבחני כימות מולקולריים. עם זאת, הדבר יקר יותר ועלול להגביל את השימוש בהם במעבדות מוגבלות במשאבים. היכולת לבצע טכניקה זו פותחת אפיקים חדשים להעריך את השינוי בשכיחות ובעוצמה של מלריה בין כמעט כל דבר אצל יתושים.

לדוגמה, השוואת יכולת וקטורית של מינים.