Протокол позволяет выявить влияние лечения на восприимчивость к малярии африканских переносчиков малярии. Например, соединения, направленные на блокирование передачи от человека к комару. Этот метод позволяет исследователям оценивать большое количество соединений в лабораторных условиях, даже до того, как будут доступны токсичные GATE.
Рассечение средней кишки может быть сложным поначалу, но это просто требует некоторой практики. Кроме того, уметь идентифицировать ооцисты не всегда легко. Во-первых, используя ротовой аспиратор, поместите 25 некормленных самок комаров Anopheles gambiae в чашку для кормления объемом 350 миллилитров.
Четко обозначьте чашки, чтобы различать контрольные и лечебные группы. Выберите количество чашек на процедуру в соответствии с количеством включенных технических реплик. Подключите систему подачи стекла к водяной бане и поддерживайте температуру на уровне 37 градусов цельсия.
Затем подготовьте кишечник коровы или синтетическую мембрану, промыв ее в водопроводной воде и разрезав на кусочки, которые подходят для каждой кормушки. Накройте нижнюю часть каждого питателя и скрепите мембрану эластичной лентой. Для использования чашек для кормления в качестве чашек для инфекции, во-первых, держите мембрану поверх сеток чашек.
Затем поместите чашки для инфекции под кормушки. Теперь добавьте один миллилитр крови, инфицированной гаметоцитами, в кормушки контрольных чашек, а зараженную гаметоцитами кровь с тестовым соединением в кормушки лечебных чашек. Затем оставьте комаров кормиться примерно на 40 минут.
После кормления выньте кормушки из чашек, промойте кормушки, обработайте лишнюю кровь гипохлоритом. Затем сбивайте всех комаров на лед в течение одной-двух минут и выбирайте комаров, которые принимали кровавую пищу, ища опухшие и красные брюшки. Замените сахарную воду, которая дается в разные дни в каждую чашку инфекции, на 10% сахарную водную прокладку и инкубируйте чашки инфекции в камере биобезопасности в течение восьми-10 дней.
Через восемь-10 дней после кормления сбивайте зараженных комаров, помещая их на лед. Затем перенесите их в меченые пробирки с 70% этанолом, сохраняя контроль в каждой группе обработки в отдельных пробирках. Разделяя контрольную и тестовую группы, перенесите комаров на маркированные чашки Петри, выстланные фильтровальной бумагой.
Добавьте каплю PBS на стеклянный слайд с соответствующей маркировкой и перенесите комара из фильтровальной бумаги в каплю. Закрепите грудную клетку комара рассекающей иглой. Затем удалите среднюю кишку, потянув седьмой брюшной сегмент щипцами, и перенесите ее в каплю 0,1% ртурохрома на новом слайде микроскопа.
Оставьте кишечник окрашиваться в течение восьми-10 минут. Затем поместите крышку на окрашенную кишку и просмотрите ее при ярком освещении поля с увеличением в 20-40 раз. Запишите количество ооцист на среднюю кишку для контрольной группы и каждой группы лечения.
В этом исследовании было обнаружено, что соединение MMV1581558 значительно ограничивает количество ооцист Plasmodium falciparum в средней кишке самок комаров Anopheles gambiae по сравнению с контролем. В контрольной группе средняя распространенность ооцист в средней кишке составила 89% при средней интенсивности 9,5 ооцист на среднюю кишку. Но в группе, получавшей лечение MMV1581558, средняя распространенность ооцист составила 36% со средней интенсивностью всего 1,5 ооцисты на среднюю кишку.
Таким образом, лечение MMV1581558 привело к 58% активности блокировки передачи и 82% активности снижения передачи во всех трех биологических репликатах. Крайне важно обеспечить, чтобы комары питались здоровой культурой гаметоцитов. Если это незрелые гаметоциты, или не гаметоциты пятой стадии, вероятность заражения комаром ограничена или невозможна.
Анализ использует метод визуальной морфологической идентификации, однако могут быть использованы молекулярные количественные анализы. Это, однако, дороже и может ограничить их использование в лабораториях с ограниченными ресурсами. Возможность использовать эту технику открывает новые возможности для оценки изменения распространенности и интенсивности малярии практически между всеми комарами.
Например, сравнение векторной способности вида.
