Das Protokoll ermöglicht es uns, die Wirkung der Behandlung auf die Malariaanfälligkeit afrikanischer Malariavektoren zu erkennen. Zum Beispiel Verbindungen, die darauf abzielen, die Übertragung vom Menschen auf die Mücke zu blockieren. Diese Technik ermöglicht es Forschern, eine große Anzahl von Verbindungen unter Laborbedingungen zu bewerten, noch bevor Toxizitäts-GATEs verfügbar sind.
Mitteldarmdissektionen können zunächst eine Herausforderung sein, aber es braucht nur etwas Übung. Auch in der Lage zu sein, Oozysten zu identifizieren, ist nicht immer einfach. Legen Sie zuerst mit einem Mundsauger 25 ungefütterte weibliche Anopheles gambiae-Mücken in einen 350-Milliliter-Futterbecher.
Beschriften Sie die Becher deutlich, um zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen zu unterscheiden. Wählen Sie die Anzahl der Becher pro Behandlung entsprechend der Anzahl der enthaltenen technischen Replikate. Schließen Sie das Glaszuführsystem an ein Wasserbad an und halten Sie die Temperatur bei 37 Grad Celsius.
Bereiten Sie dann den Kuhdarm oder die synthetische Membran vor, indem Sie ihn in Leitungswasser spülen und in Stücke schneiden, die für jeden Feeder angebracht sind. Decken Sie den unteren Teil jedes Feeders ab und befestigen Sie die Membran mit einem elastischen Band. Um die Futterbecher als Infektionsbecher zu verwenden, halten Sie zuerst die Membran oben auf den Netzen der Becher.
Stellen Sie dann die Infektionsbecher unter die Futterautomaten. Fügen Sie nun einen Milliliter Gametozyten-infiziertes Blut zu den Feedern der Kontrollbecher und Gametozyten-infiziertes Blut mit einer Testverbindung zu den Feedern der Behandlungsbecher hinzu. Dann lassen Sie die Moskitos etwa 40 Minuten lang füttern.
Entfernen Sie nach der Fütterung die Feeder aus den Tassen, spülen Sie die Feeder aus und behandeln Sie das überschüssige Blut mit Hypochlorit. Dann schlagen Sie alle Moskitos für ein bis zwei Minuten auf das Eis und wählen Sie die Moskitos aus, die eine Blutmahlzeit eingenommen haben, indem Sie nach geschwollenen und roten Bäuchen suchen. Ersetzen Sie das Zuckerwasser, das an wechselnden Tagen zu jedem Infektionsbecher gegeben wird, durch ein 10% Zuckerwasserkissen und inkubieren Sie die Infektionsbecher in einer Biosicherheitskammer für acht bis 10 Tage.
Acht bis 10 Tage nach der Fütterung schlagen Sie die infizierten Moskitos nieder, indem Sie sie auf Eis legen. Dann geben Sie sie in beschriftete Röhrchen mit 70% Ethanol und behalten Sie die Kontrolle in jeder Behandlungsgruppe in separaten Röhrchen. Halten Sie die Kontroll- und Testgruppen getrennt und übertragen Sie die Moskitos auf beschriftete Petrischale, die mit Filterpapier ausgekleidet sind.
Fügen Sie einen Tropfen PBS auf einen entsprechend gekennzeichneten Glasobjektträger und übertragen Sie eine Mücke vom Filterpapier auf den Tropfen. Stecken Sie den Thorax der Mücke mit der Seziernadel fest. Entfernen Sie dann den Mitteldarm, indem Sie das siebte Bauchsegment mit einer Pinzette ziehen, und übertragen Sie es auf einen Tröpfchen von 0,1% Mercurochrom auf einem neuen Objektträger.
Lassen Sie den Darm acht bis 10 Minuten einfärben. Legen Sie dann einen Deckstreifen auf den fleckigen Darm und betrachten Sie ihn unter heller Feldbeleuchtung bei 20- bis 40-facher Vergrößerung. Notieren Sie die Anzahl der Oozysten pro Mitteldarm für die Kontrolle und jede Behandlungsgruppe.
In dieser Studie wurde festgestellt, dass die Verbindung MMV1581558 die Anzahl der Plasmodium falciparum-Oozysten im Mittelbauch weiblicher Anopheles gambiae-Mücken im Vergleich zur Kontrolle signifikant einschränkt. In der Kontrollgruppe betrug die durchschnittliche Prävalenz von Oozysten im Mitteldarm 89% mit einer durchschnittlichen Intensität von 9,5 Oozysten pro Mitteldarm. Aber in der mit MMV1581558 behandelten Gruppe betrug die durchschnittliche Prävalenz von Oozysten 36% mit einer durchschnittlichen Intensität von nur 1,5 Oozysten pro Mitteldarm.
So führte die Behandlung mit MMV1581558 in allen drei biologischen Replikaten zu einer 58%igen transmissionsblockierenden Aktivität und einer 82%igen transmissionsreduzierenden Aktivität. Es ist wichtig sicherzustellen, dass sich Moskitos von einer gesunden Gametozytenkultur ernähren. Wenn es sich um unreife Gametozyten oder nicht um Gametozyten im fünften Stadium handelt, ist die Wahrscheinlichkeit, eine Infektion in der Mücke zu bekommen, begrenzt oder unmöglich.
Der Assay verwendet eine visuelle morphologische Identifizierungsmethode, jedoch können molekulare Quantifizierungsassays verwendet werden. Dies ist jedoch kostspieliger und könnte ihre Verwendung in Laboratorien mit begrenzten Ressourcen einschränken. Die Fähigkeit, diese Technik durchzuführen, eröffnet neue Wege, um die Veränderung der Malariaprävalenz und -intensität zwischen fast allem in Moskitos zu bewerten.
Zum Beispiel der Vergleich der vektoriellen Kapazität von Arten.
