נוגדנים משמשים באופן שגרתי בטכניקות מעבדה ויומי הטיפול והאבחון שלהם מתרחבים במהירות. אפיון מחייב אנטיגן-נוגדן מהיר ומדויק חשוב ביותר ליישומים אלה. פוטומטריה המונית מודדת במהירות זיקה מחייבת באמצעות כמויות קטנות מאוד של חומר.
אין צורך בתיוג או קיבוע ומידע על אוליגומריזציה של חלבונים וטוהר ניתן להשיג מאותו ניסוי. פרוטוקול זה יכול לשמש לא רק כדי ללמוד נוגדנים, אלא גם כדי למדוד קשירות חלבון חלבון חזק עבור חלבונים עם מסה מולקולרית גדולה מ 50 קילודלטונים. התחל על ידי שימוש במטליות קצה רך ולשטוף בקבוקים כדי לשטוף ברצף 24 על ידי 50 מילימטר מכסה מלמעלה למטה עם מים מזוקקים, אתנול, מים מזוקקים, isopropanol, ומים מזוקקים.
לאחר הכביסה האחרונה, לייבש את coverslips עם זרם של חנקן נקי באותו כיוון, כדי למנוע העברת זיהום מן המדפים. לשטוף 24 על ידי 24 מילימטר מכסה עם מים מזוקקים ואתנול כפי שהוכח, ואחריו ייבוש עם זרם של חנקן נקי. לאחר הייבוש, מניחים כיסוי של 24 על 24 מילימטרים על פיסת רדיד אלומיניום וממקמים רצועות של סרט הדבקה דו-צדדי על המכסה.
ואז לחתוך את 24 על ידי 24 מילימטר coverslip מתוך נייר הכסף בעדינות ללחוץ על נייר כסף על הצד העובד של 24 על ידי 50 מילימטר coverslip. כדי להכין דגימות נוגדנים אנטיגן למדידות הזיקה, לסנן לפחות שני מיליליטר של PBS באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרון כדי להסיר חלקיקי אבק אגרגטים, ו צנטריפוגה את מלאי הנוגדנים ואנטיגן של עניין. למדוד את ספיגת 280 ננומטר UV של מלאי הנוגדנים ואנטיגן כדי לקבוע את הריכוזים בפועל שלהם, ולהכין סדרה של תערובות נוגדנים אנטיגן בטווח המתאים של ריכוזי אנטיגן בנפח סופי של 50 microliters לכל מדגם.
לאחר מכן להדגיר את תערובות נוגדני אנטיגן במשך כ 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את התגובה מחייב להגיע שיווי משקל כימי. כדי להעריך את זיקה נוגדן אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית, להחיל טיפה של שמן טבילה מיקרוסקופ על מטרת המכשיר ולהחיל את תא הזרימה על הבמה של המיקרוסקופ. הוסף 10 מיקרוליטרים של PBS מסונן לקצה אחד של ערוץ תא הזרימה.
המאגר ייכנס לערוץ בפעולה נימית. בכרטיסייה בקרת המיקוד של תוכנת איסוף הנתונים, השתמש בלחצנים גסים שלב למעלה ולמטה כדי לבצע את ההתאמות הראשוניות ולחץ על חדות כדי להציג את קריאת אות החדות. השתמש בלחצני ההתאמה העדינים למעלה ולמטה כדי למקסם את ערך החדות ולחץ על הגדרת מיקוד ונעל את המוקד כדי להפעיל את פונקציית המעקב אחר המוקד.
תמונה של שקופית נקייה צריכה להיות ערך אות שווה או מתחת ל- 0.05%Load 20 microliters של דגימת נוגדן אנטיגן הראשונה כפי שהוכח, סופג את הנוזל מהחלק השני עם פיסת נייר סופג קטנה. מיד לאחר הטעינה, לחץ על רשומה כדי להשיג את המספר המתאים של מסגרות שוות ערך ל- 100 שניות של נתונים. בסוף תקופת איסוף הנתונים, הזן שם קובץ עבור הנתונים ולחץ על אישור ולאחר מכן תדגום כדי לשמור את הקובץ.
כדי לנתח את נתוני פוטומטריית המסה, פתח את קובץ העניין ולחץ על נתח. לחץ על טען כדי לטעון את פונקציית הכיול ולחץ על קובץ ושמור תוצאות כדי לשמור את הנתונים שנותחו. כדי להשיג את הריכוזים היחסיים של כל מין בדגימה, פתח את האירועים.
קובץ csv, העתק את הנתונים בעמודה M לתוכנה המתאימה להתוויה וניתוח, ולהשתמש בפונקציית היסטוגרמה של סטטיסטיקת התוויית נתונים כדי להתוות את התפלגות המסה המולקולרית. לחץ פעמיים על ההיסטוגרמה כדי לפתוח את חלון מאפייני ההתוויה, להשבית את binning אוטומטית, ובחר גודל סל של 2.5 קילודאלטון. כדי ליצור את מרכזי המחסנים ולספירת נתונים, לחץ על החל ולך.
כדי להתאים את ההיסטוגרמה לפונקציות גאוסיאניות, בחר את מרכזי סל וספירת העמודות ולחץ על פסגות הניתוח ופונקציית התפריט הבסיסית מרובת שיאים. לחץ פעמיים כדי לציין את מיקומי השיא המשוערים בהתווית ההפצה ולחץ על פתח את NL fit. בדוק את תיבות הסימון הקבועות עבור מרכזי השיא של XC והגדר את ערכיהם למסות המולקולריות הצפויות של הנוגדן החופשי ולתסבימי נוגדני האנטיגן הבודדים והכפילים.
בדוק את אפשרות השיתוף עבור פרמטרי הרוחב ולחץ על התאם. ערכי שיא הגובה המותאמים של הרכיבים הגאוסיאניים מייצגים את הריכוז היחסי של כל מין בדגימה. לאחר מכן השתמש במשוואה כדי לחשב את שבר הריכוז של כל מין ערכי שיא גובה.
כדי לחשב קבועי שיווי משקל באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני, פתח את חישוב הדיסוציאציה. גליון עבודה xlsx. בגליון עבודה זה, ניתן לשנות את ערכי התא המסומן הצהוב בשורות 1 עד 10 כדי לבצע את חישובי קבוע שיווי המשקל.
הזן את ערכי קבוע הדיסוציאציה המשוערים ביחידות ננו-מולאר לתאים B1 ו- B2. אם הערכים הקבועים המשוערים של דיסוציאציה אינם ידועים, השאר את ערכי ברירת המחדל בתאים B1 ו- B2 ללא שינוי. הזן את ריכוזי הנוגדנים והאנטיג'ן הכוללים ביחידות ננומולריות לתאים D2 ו- E2 והזן את ערכי השבר המחושבים עבור כל מין לתאים F2, G2 ו- H2. בעת ביצוע ניתוח כללי של ההקצבה, הוסף את ערכי שברי הנתונים המתאימים לשורות 2 עד 10. בחלון הפרמטרים Solver, בחר תא B15 עבור התיבה המטרה set ותאים B1 עד B2 עבור התיבה על-ידי שינוי תאים משתנים.
בחר את לחצן min עבור האפשרות אל ובדוק את תיבת הסימון הפוך משתנים ללא הגבלה ללא שליליים ולאחר מכן בחר GRG לא ליניארי כשיטה לפתרון ולחץ על פתור. הערכים הקבועים הטובים ביותר של דיסוציאציה יוצגו בתאים B1 ו- B2. ואת הסכום הסופי של שגיאות בריבוע יוצגו בתא B15. בניסוי מייצג זה, סדרת טיטרציה עם נוגדן הטרומבין האנטי-אנושי בריכוז קבוע של 25 ננומולרים ו-0, 7.5, 15, 30, 60 ו-120 ריכוזי אלפא-טרומבין אנושיים ננומולריים בוצעו כדי להשיג את ההתפלגות המונית המולקולרית של תערובות נוגדני האנטיגן והנוגדן בלבד.
הפרמטרים הטובים ביותר בגובה שיא של הרכיבים הגאוסיאניים היו מנורמלים כדי להשיג שברי ריכוז מינים. ערכי שבר הריכוז התאימו אז ברחבי העולם כדי להשיג את הזיקה לקשירת נוגדנים אנטיגן. לאחר מכן ניתן היה לתכנן את שברי הריכוז הניסיוניים ואת תוצאות יתאימו הגלובליות לנוגדנים החופשיים, לתסביך נוגדן אנטיגן יחיד ולתסביך אנטיגן כפול.
כדי להשיג ערכי KD מדויקים, ריכוזי חלבונים צריכים להיבחר בקפידה כדי לאכלס את כל מיני התגובות. מומלץ להכין סדרת טיטריות באמצעות מגוון ריכוזי אנטיגן. לאחר התאמת הנתונים, ניתן להשתמש בשיטת הקרנה השגיאה כדי להשיג את שגיאת ההתאמה, אך עדיף לחזור על הניסוי ולחשב את סטיות התקן של ערכי הזיקה הממוצעים.
