פרוטוקול הציטומטריה של זרימה מרובת פרמטרים שלנו מאפשר זיהוי מהיר ומשופר של סנסנציה הנגרמת על ידי טיפול בתאי הגידול, המהווה תנאי למחקר מתמשך בביולוגיה ובטיפול בסרטן. בדיקת הציטומטריה של הזרימה שלנו מהירה יותר מבדיקות קיימות המבוססות על מיקרוסקופיה. אנו משתמשים בשני סמנים, במקום רק אחד, כדי לזהות תאים סנסנטיים, ובכך לשפר את אמינות הבדיקה.
תאים יכולים להיות מוכתמים יחד עם נוגדנים פלואורסצנטיים כדי לזהות מטרות נוספות של עניין. ניתן להשתמש במיון ציטומטריה של זרימה כדי להעשיר אוכלוסיות של תאים סנסנטיים לצורך ניתוח במורד הזרם. הבדיקה יכולה לזהות תאים סנסנטיים בקווי תאים סרטניים בתרבית, או בדגימות גידול שלמות לאחר דיסוציאציה עדינה.
לפני שתנסה טכניקה זו, חשוב להכיר את נהלי ההפעלה הכלליים של ציטומטר הזרימה המשמש. אנא עיין בטקסט לקבלת מפרטים מומלצים של ציטומטר זרימה. יום אחד לפני השראת הסנסנציה על ידי תרופות, קצרו את תרבית קו התאים הסרטניים עם 0.25% טריפסין EDTA.
מניחים את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי להפעיל טריפסין, ומנתקים את התא מונולייר. כאשר המונולאייר התנתק באופן נראה לעין, נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת נפח שווה של מדיום תרבות שלם. העבר את ההשעיה התאית לצינור חרוטי סטרילי.
לספור את התאים בשיטת ההמוציטומטר הסטנדרטית, ולרשום תאים למיליליטר. תאי צלחת באחת כפול 10 עד השלישי עד 10 פעמים 10 עד השלישי לתאים לסנטימטר מרובע בצלחת תרבית פלסטיק סטנדרטית של שש בארות. יש לדגום את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ולחות.
למחרת, לטפל בתאים עם סוכן מעורר סנסנציה של עניין, כגון etoposide. לאחר מכן לדגור במשך ארבעה ימים כדי לאפשר את הופעת senescence. בחנו את התאים מדי יום תחת מיקרוסקופ אור כדי לאתר את השינויים המורפולוגיים הצפויים.
לאחר תחילת הסנסנציה, קצור את התאים על ידי הוספת טריפסין EDTA במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים מנותקים לתוך ההשעיה, לנטרל טריפסין עם נפח שווה של מדיום שלם. העבר כל באר של תרחיף התא לתוך צינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר.
ספרו את התאים שוב והכניסו מספר שווה של תאים לכל דגימה לקבוצה חדשה של צינורות. צנטריפוגה את הצינורות במשך חמש דקות ב 1, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס ולהסיר את supernatant. ראשית, התאם את ה- pH הליזוזומלי של דגימות תאים בתרבית על ידי הוספת תמיסה של בפילומיצין מיקרומולרי אחד ב- DMEM לכדור התא בריכוז של פעם אחת 10 לתאים השישיים למיליליטר, ופיפטה לערבוב.
דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על סיבוב במהירות איטית. לאחר מכן, כדי להכתים את הבטא-גלקטוזידאז הקשור לסנסנציה, הוסיפו תמיסת מלאי DDAOG ב-10 מיקרוגרם למיליליטר לדגימות ללא שטיפה. מניחים על מסובב במשך 60 דקות מוגן מפני אור ישיר.
כמו קודם, צנטריפוגה את הצינורות, להסיר את supernatant, ולשטוף את הכדור עם מיליליטר אחד של קרח קר 0.5% BSA ב PBS. לאחר מכן הוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת Calcein Violet 450 AM מדוללת לכדורי התא השטופים. לדגור במשך 15 דקות על קרח בחושך.
העבר את דגימות התאים לצינורות תואמי מכשיר ציטומטריה זורמים. בתוכנת רכישת הנתונים, פתח היסטוגרמה של ערוץ סגול וערוץ אדום רחוק לעומת עלילת נקודה של ערוץ ירוק. התחל איסוף נתוני ציטומטר במהירות כניסה נמוכה והנח את דגימות הבקרה החיוביות המוכתמות ב- DDAOG על יציאת הכניסה.
התחל לרכוש נתונים לדוגמה. התאם את מתחי הערוץ כך שיותר מ -90% מהאירועים כלולים בכל עלילה. כאשר כל ההגדרות הן אופטימליות, הקלט 10, 000 אירועים לכל מדגם.
הניחו את דגימות הבקרה לרכב בלבד מוכתמות ב-DDAOG על פתח הכניסה. התחל רכישת נתונים ותעד 10, 000 אירועים לכל מדגם. חפש עלייה ב-autofluorescence, או AF, ואות DDAO-גלקטוזיד לעומת שליטה חיובית.
שמור את הנתונים לדוגמה בתבנית קובץ fcs וייצא את הקבצים למחשב תחנת עבודה המצויד בתוכנת ניתוח ציטומטריה של זרימה. באמצעות תוכנת ניתוח נתונים ציטומטריה, טען את קבצי הנתונים של fcs עבור כל הדוגמאות שנרכשו. ראשית, כדי לשער תאים בני קיימא, לחץ פעמיים על נתוני הדגימה עבור פקד הרכב בלבד כדי לפתוח את חלון הנתונים שלו.
הצג את הנתונים באופן חזותי כהיסטוגרמה של ערוץ סגול. התאים בני הקיימא המוכתמים, המוכתמים על ידי CV 450, מבוססים על הפלואורסצנטיות הבהירה יותר שלהם מאשר התאים המתים. צייר שער באמצעות הכלי היסטוגרמה שער יחיד כדי לכלול תאים בני קיימא בלבד.
תן שם לשער קיימא. לאחר מכן גררו את שער ה-קיימא אל דגימות התאים האחרות מחלון פריסת הדגימה כדי להחיל את השער באופן אחיד. פתח את החלון פריסה.
בחלון 'פריסה', הצג באופן חזותי את כל הדוגמאות כהיסטוגרמות של ערוץ סגול. ודא שסידור תאים בר-קיימא מתאים לדגימות שונות. אם לא, התאם לפי הצורך.
לאחר מכן, כדי לשער תאים סנסנטיים, לחץ פעמיים על נתוני התאים המגודרים עבור הבקרה לרכב בלבד כדי לפתוח את חלון הנתונים שלו. לאחר מכן הצג את הנתונים באופן חזותי כמתווה נקודה עבור הערוץ האדום הרחוק לעומת הערוץ הירוק. ציירו שער באמצעות הכלי Rectangle Gating כדי לכלול פחות מ-5% מהתאים החיוביים ל-DDAO ותאים חיוביים ל-AF מהרביע הימני העליון.
תן לשער את השם Senescent. לאחר מכן גררו את שער Senescent אל תת-הערכה בת הקיימא של כל הדגימות מחלון הפריסה לדוגמה כדי להחיל את השער באופן אחיד. לתוך החלון פריסה, גרור ושחרר את כל קבוצות המשנה המגודרות בתאים.
הצג באופן חזותי את כל הדגימות הקיימות כנקודות ערוץ אדומות רחוקות לעומת ירוקות, והתבונן בתוצאות. ודא שהשער הסנסנטי גלוי בכל המגרשים ושהשער לפקדים לרכב בלבד מציג פחות מ-5% תאים סנסנטיים. הניתוח הושלם כעת.
כעת ניתן לייצא נתונים לפי הצורך בתבנית גרפית וטבלה. בהשוואה לתאים שלא טופלו, תאי מלנומה B16-F10 סנסנטיים המושרים על ידי אטופוסיד הציגו מורפולוגיה מוגדלת וכתמים כחולים עקב ביקוע של X-gal על ידי בטא-גלקטוזידאז גבוה הקשור לסנסנציה. צביעה של תאים שטופלו באטופוזיד עם C12FDG פלואורסצנטי, או DDAOG הדגימה דפוסי צביעה דומים ושינויי עוצמה ל-X-gal.
עם זאת, הודגם כי פליטת C12FDG תאית חופפת לפליטת C12FDG ירוקה מצטברת בתאים סנסנטיים לא מוכתמים. לעומת זאת, אוטופלואורסצנציה הייתה בדרך כלל זניחה בטווח הפליטה האדום-רחוק של DDAOG. כאן מוצגים מיקרו-ספירות של נתוני ציטומטר זרימה עבור חלקות פיזור, מיקרו-כדורים של כיול פלואורסצנטי מסחרי של חמישה פסגות קשת ונתוני פלואורסצנציה חד-ערוציים מתאים מוכתמים.
נתוני בדיקת ציטומטר זרימה DDAOG עבור תאי מלנומה B16-F10 הראו כי סנסנס המושרה על ידי טיפול, או TIS, המושרה על ידי אטופוסיד התרחשה ב -35% מהתאים בני קיימא, והסוכן הסנוליטי ABT-263 כמעט חיסל תאי טיס. בתאי סרטן ריאה A549, TIS המושרה על ידי בלומיצין ב-66% מהתאים בני קיימא ו-ABT-263 הפחיתו את האחוז ל-15. ABT-263 לבדו לא היה רעיל לתאים מתרבים שלא טופלו.
בבדיקת צביעת נוגדנים, היסטוגרמה של נתוני ערוץ PE הראתה כי 42% מהתאים שטופלו באטופוסיד היו חיוביים עבור סמן הסנסנציה DPPP4-חיובי. יתר על כן, הדמיה עם עלילות נקודה דו-ממדיות הצביעה על כך ש-44% מהתאים שטופלו באטופוסיד היו חיוביים פי שניים עבור DDAOG ו-DPP4 לעומת 4% מתאי הרכב בלבד. קיבוע של תאים מוכתמים DDAOG הוערך הבא.
בהשוואה לדגימות בקרה לא מתוקנות, דגימות קבועות הציגו רקע מעט גבוה יותר בתאים לא מטופלים עם אחוז גבוה יותר של תאים בעלי ניקוד כסנסנטי בתאים שטופלו ב-BLM. השפעה זו נצפתה גם בדגימות קבועות שאוחסנו בן לילה, ובמשך שבוע אחד בארבע מעלות צלזיוס. מיון ציטומטריה של זרימה ואימות של אוכלוסיות תאים סנסנטיים מועשרים על ידי מורפולוגיה וסמני התפשטות מוצגים.
תאים סנסנטיים ממוינים הציגו מורפולוגיה מוגדלת, כצפוי, שהומחשה על ידי צביעת אקטין בפלואורסצנט פלואידין. ירידה באות עבור סמן התפשטות Ki67 נצפתה גם על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית. לבסוף, הוערך כימות של סנסנציה בגידולים שטופלו בתרופות כימותרפיות.
צביעת X-gal ברקמות הייתה חלשה יחסית, אך כתמים כחולים ניכרו בגידולים שטופלו בדוקסורוביצין, או דוקסורוביצין ליפוזומלי פגיאלי, במיוחד בגידולים שגם קיבלו ציון חיובי לסנסנציה על ידי בדיקת זרימה DDAO-גלקטוזיד. כצפוי, גידולים מלוחים בלבד הפגינו זניחות זניחה. כאן, כמו בכל בדיקת תא חי, שלבי הפרוטוקול צריכים להתבצע ביעילות, אך בעדינות.
יש להימנע מהליכי צביעה ממושכים, או דגירה מעבר לזמנים שהוזכרו. אם תאים סנסנטיים ממוינים בצורה ציטומטרית של זרימה, ניתן להחזיר אותם לתרבית לצורך בדיקות חיסוניות, או לשכב, ולעבד אותם לניתוח אומיקה, כולל תעתיק, או פרוטאומיקה. טכניקה זו אפשרה למעבדה שלנו ולאחרים לזהות תכונות חדשות של תאי גידול סנסנטיים, כולל כימות של נזק לדנ"א, ביטוי חלבונים ושינויים בחילוף החומרים.
