يتيح بروتوكول قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات الخاص بنا الكشف السريع والمحسن عن الشيخوخة التي يسببها العلاج في الخلايا السرطانية ، وهو شرط للدراسة المستمرة في بيولوجيا السرطان وعلاجه. يعد اختبار شيخوخة قياس التدفق الخلوي لدينا أسرع من المقايسات الحالية القائمة على الفحص المجهري. نستخدم علامتين ، بدلا من علامة واحدة فقط ، لتحديد الخلايا الهرمة ، وتحسين موثوقية الفحص.
يمكن تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة الفلورية للكشف عن أهداف إضافية ذات أهمية. يمكن استخدام فرز التدفق الخلوي لإثراء مجموعات الخلايا الهرمة لتحليل المصب. يمكن للفحص اكتشاف الخلايا الهرمة في خطوط الخلايا السرطانية المستزرعة ، أو في عينات الورم الكاملة بعد التفكك اللطيف.
قبل محاولة هذه التقنية ، من المهم أن تكون على دراية بإجراءات التشغيل العامة لمقياس التدفق الخلوي المستخدم. يرجى الرجوع إلى النص للحصول على مواصفات مقياس التدفق الخلوي الموصى بها. قبل يوم واحد من تحريض الشيخوخة عن طريق الأدوية ، احصد ثقافة خط الخلايا السرطانية باستخدام 0.25٪ تربسين EDTA.
ضع الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لتنشيط التربسين ، وافصل الطبقة الأحادية للخلية. عندما تنفصل الطبقة الأحادية بشكل واضح ، قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة حجم متساو من وسط الاستزراع الكامل. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي معقم.
عد الخلايا باستخدام طريقة مقياس الدم القياسية ، وسجل الخلايا لكل ملليلتر. خلايا الصفيحة في واحد في 10 أس ثالث إلى 10 في 10 أس الخلايا الثالثة لكل سنتيمتر مربع في صفيحة استزراع بلاستيكية قياسية من ستة آبار. احتضان الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والرطوبة.
في اليوم التالي ، عالج الخلايا بالعامل المثير للشيخوخة ، مثل إيتوبوسيد. ثم احتضان لمدة أربعة أيام للسماح ببداية الشيخوخة. افحص الخلايا يوميا تحت المجهر الضوئي لمعرفة التغيرات المورفولوجية المتوقعة.
بعد بداية الشيخوخة ، احصد الخلايا بإضافة التربسين EDTA لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. عندما يتم فصل الخلايا إلى تعليق ، تحييد التربسين بحجم متساو من الوسط الكامل. انقل كل بئر من معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 ملليلتر.
عد الخلايا مرة أخرى واحصل على عدد متساو من الخلايا لكل عينة في مجموعة جديدة من الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي للأنابيب لمدة خمس دقائق عند 1،000 غرام عند أربع درجات مئوية وإزالة المادة الطافية. أولا ، اضبط الرقم الهيدروجيني الليزوزومي لعينات الخلايا المستزرعة عن طريق إضافة محلول من بافيلوميسين ميكرومولار واحد في DMEM إلى حبيبات الخلية بتركيز واحد في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر ، وماصة للخلط.
احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية على الدوار بسرعة بطيئة. ثم لصبغ بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة ، أضف محلول مخزون DDAOG بمعدل 10 ميكروغرام لكل ملليلتر إلى العينات دون غسل. ضعه على دوار لمدة 60 دقيقة محميا من الضوء المباشر.
كما كان من قبل ، قم بطرد الأنابيب بالطرد المركزي ، وإزالة المادة الطافية ، وغسل الحبيبات بملليلتر واحد من الثلج البارد 0.5٪ BSA في PBS. ثم أضف 300 ميكرولتر من محلول Calcein Violet 450 AM المخفف إلى كريات الخلايا المغسولة. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد في الظلام.
نقل عينات الخلية إلى أنابيب متوافقة مع أداة قياس الخلايا. في برنامج الحصول على البيانات ، افتح مدرج تكراري للقناة البنفسجية وقناة حمراء بعيدة مقابل مخطط نقطة القناة الخضراء. ابدأ في الحصول على بيانات مقياس الخلايا بسرعة سحب منخفضة وضع عينات التحكم الإيجابية الملطخة ب DDAOG على منفذ السحب.
البدء في الحصول على عينة من البيانات. اضبط جهد القناة بحيث يتم احتواء أكثر من 90٪ من الأحداث داخل كل مخطط. عندما تكون جميع الإعدادات مثالية ، سجل 10،000 حدث لكل عينة.
ضع عينات التحكم في السيارة فقط الملطخة ب DDAOG على منفذ السحب. بدء الحصول على البيانات وتسجيل 10،000 حدث لكل عينة. ابحث عن زيادة في التألق الذاتي ، أو AF ، وإشارة DDAO-galactoside مقابل التحكم الإيجابي.
احفظ عينة البيانات بتنسيق ملف fcs ، وقم بتصدير الملفات إلى كمبيوتر محطة عمل مزود ببرنامج تحليل قياس التدفق الخلوي. باستخدام برنامج تحليل بيانات قياس الخلايا ، قم بتحميل ملفات بيانات FCS لجميع العينات التي تم الحصول عليها. أولا ، لبوابة الخلايا القابلة للحياة ، انقر نقرا مزدوجا فوق بيانات العينة للتحكم في السيارة فقط لفتح نافذة البيانات الخاصة بها.
تصور البيانات كمدرج تكراري للقناة البنفسجية. تعتمد الخلايا القابلة للحياة الملطخة ، الملطخة ب CV 450 ، على مضانها الأكثر إشراقا من الخلايا الميتة. ارسم بوابة باستخدام أداة الرسم البياني أحادي البوابة لتضمين الخلايا القابلة للحياة فقط.
اسم البوابة قابلة للحياة. ثم اسحب البوابة القابلة للتطبيق إلى عينات الخلايا الأخرى من نافذة تخطيط العينة لتطبيق البوابة بشكل موحد. افتح نافذة التخطيط.
في نافذة التخطيط، تصور كل العينات كرسوم بيانية للقناة البنفسجية. تحقق من أن بوابات الخلايا القابلة للحياة مناسبة عبر العينات. إذا لم يكن كذلك ، اضبط حسب الحاجة.
بعد ذلك ، لبوابة الخلايا الهرمة ، انقر نقرا مزدوجا فوق بيانات الخلية القابلة للتطبيق المسورة للتحكم في السيارة فقط لفتح نافذة البيانات الخاصة بها. ثم تصور البيانات كمخطط نقطي للقناة الحمراء البعيدة مقابل القناة الخضراء. ارسم بوابة باستخدام أداة بوابة المستطيل لتضمين أقل من 5٪ من الخلايا الإيجابية DDAO وإيجابية التركيز البؤري التلقائي من الربع الأيمن العلوي.
قم بتسمية البوابة باسم شيخوخة. ثم اسحب بوابة الشيخوخة إلى المجموعة الفرعية القابلة للتطبيق لجميع العينات من نافذة تخطيط العينة لتطبيق البوابة بشكل موحد. في نافذة التخطيط، اسحب جميع المجموعات الفرعية القابلة للتطبيق ذات بوابات الخلايا وأفلتها.
تصور جميع العينات القابلة للتطبيق كمخططات نقطية حمراء بعيدة مقابل قناة خضراء ، ولاحظ النتائج. تأكد من أن بوابة الشيخوخة مرئية على جميع قطع الأراضي وأن بوابة عناصر التحكم في السيارة فقط تعرض أقل من 5٪ من الخلايا الهرمة. اكتمل التحليل الآن.
يمكن الآن تصدير البيانات حسب الرغبة في شكل رسوم بيانية وجدول. بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة ، أظهرت خلايا سرطان الجلد B16-F10 الهرمة التي يسببها إيتوبوسيد مورفولوجيا متضخمة وتلطيخا أزرق بسبب انشقاق X-gal بواسطة ارتفاع بيتا غالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة. أظهر تلطيخ الخلايا المعالجة بالإيتوبوسيد باستخدام C12FDG الفلوري ، أو DDAOG أنماط تلطيخ مماثلة واختلافات في الشدة مع X-gal.
ومع ذلك ، تبين أن التألق الذاتي الخلوي المتداخل مع انبعاث C12FDG الأخضر يتراكم في الخلايا الهرمة غير الملوثة. في المقابل ، كان التألق الذاتي عادة ضئيلا في نطاق الانبعاثات الأحمر البعيد ل DDAOG. يتم هنا عرض إعداد الحصول على بيانات مقياس التدفق الخلوي لمخططات التشتت ، والكرات المجهرية لمعايرة الفلورسنت التجارية ذات قوس قزح ذات الخمس قمم ، وبيانات التألق أحادية القناة من الخلايا الملطخة.
أظهرت بيانات مقايسة شيخوخة مقياس التدفق الخلوي DDAOG لخلايا سرطان الجلد B16-F10 أن الشيخوخة المستحثة بالعلاج ، أو TIS ، التي يسببها إيتوبوسيد حدثت في 35٪ من الخلايا القابلة للحياة ، وأن العامل السينوليتيك ABT-263 قضى تقريبا على خلايا TIS. في خلايا سرطان الرئة A549 ، خفضت TIS التي يسببها بليوميسين في 66٪ من الخلايا القابلة للحياة و ABT-263 النسبة المئوية إلى 15. لم يكن ABT-263 وحده ساما للخلايا المتكاثرة غير المعالجة.
في اختبار تلطيخ مشترك للأجسام المضادة ، أظهر الرسم البياني لبيانات قناة PE أن 42٪ من الخلايا المعالجة بالإيتوبوسيد كانت إيجابية لعلامة الشيخوخة DPPP4 إيجابية. علاوة على ذلك ، أشار التصور باستخدام مخططات نقطية ثنائية الأبعاد إلى أن 44٪ من الخلايا المعالجة بالإيتوبوسيد كانت إيجابية مزدوجة ل DDAOG و DPP4 مقابل 4٪ من الخلايا التي تحتوي على مركبة فقط. تم تقييم تثبيت الخلايا الملطخة DDAOG بعد ذلك.
بالمقارنة مع عينات التحكم غير الثابتة ، أظهرت العينات الثابتة خلفية أعلى قليلا في الخلايا غير المعالجة مع نسبة أعلى من الخلايا التي سجلت الشيخوخة في الخلايا المعالجة ب BLM. وقد لوحظ هذا التأثير أيضا في العينات الثابتة المخزنة طوال الليل ، ولمدة أسبوع واحد عند أربع درجات مئوية. يتم عرض فرز قياس التدفق الخلوي والتحقق من صحة مجموعات الخلايا الهرمة المخصبة عن طريق التشكل وعلامات الانتشار.
أظهرت الخلايا الهرمة التي تم فرزها مورفولوجيا متضخمة ، كما هو متوقع ، تم تصورها عن طريق تلطيخ الأكتين بالقضيب الفلوري. كما لوحظ انخفاض في إشارة علامة الانتشار Ki67 عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي. أخيرا ، تم تقييم القياس الكمي للشيخوخة في الأورام المعالجة بأدوية العلاج الكيميائي.
كان تلطيخ X-gal في الأنسجة ضعيفا نسبيا ، لكن التلوين الأزرق كان واضحا في الأورام التي عولجت بدوكسوروبيسين ، أو دوكسوروبيسين الشحمي pegylated ، خاصة في الأورام التي سجلت أيضا نتائج إيجابية للشيخوخة بواسطة مقايسة تدفق DDAO-galactoside. كما هو متوقع ، أظهرت الأورام المالحة فقط شيخوخة ضئيلة. هنا ، كما هو الحال مع أي فحص للخلايا الحية ، يجب تنفيذ خطوات البروتوكول بكفاءة ، ولكن بلطف.
يجب تجنب إجراءات التلوين المطولة ، أو الحضانة بعد الأوقات المذكورة. إذا تم فرز الخلايا الهرمة خلويا ، فيمكن وضعها مرة أخرى في مزرعة للمقايسات المناعية ، أو تحليلها ، ومعالجتها لتحليل omics ، بما في ذلك النسخ ، أو البروتينات. مكنت هذه التقنية مختبرنا وغيره من تحديد السمات الجديدة للخلايا السرطانية الهرمة ، بما في ذلك القياس الكمي لتلف الحمض النووي ، والتعبير عن البروتين ، والتغيرات في التمثيل الغذائي.
