Nosso protocolo de citometria de fluxo multiparâmetro permite a detecção rápida e aprimorada da senescência induzida pela terapia em células tumorais, que é uma condição de estudo em andamento na biologia e terapia do câncer. Nosso ensaio de senescência por citometria de fluxo é mais rápido do que os ensaios baseados em microscopia existentes. Usamos dois marcadores, em vez de apenas um, para identificar células senescentes, melhorando a confiabilidade do ensaio.
As células podem ser co-coradas com anticorpos fluorescentes para detectar alvos adicionais de interesse. A classificação por citometria de fluxo pode ser usada para enriquecer populações de células senescentes para análise a jusante. O ensaio pode detectar células senescentes em linhagens de células cancerígenas cultivadas ou em amostras tumorais inteiras após dissociação suave.
Antes de tentar esta técnica, é importante estar familiarizado com os procedimentos operacionais gerais do citômetro de fluxo que está sendo usado. Consulte o texto para obter as especificações recomendadas do citômetro de fluxo. Um dia antes da indução da senescência por drogas, colha a cultura da linhagem celular cancerígena com EDTA de tripsina a 0,25%.
Coloque as células a 37 graus Celsius por cinco minutos para ativar a tripsina e desprenda a monocamada celular. Quando a monocamada tiver se desprendido visivelmente, neutralize a tripsina adicionando um volume igual de meio de cultura completo. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico estéril.
Conte as células usando o método padrão do hemocitômetro e registre as células por mililitro. Células de placa em uma vez 10 a terceira a 10 vezes 10 a terceira células por centímetro quadrado em uma placa de cultura plástica padrão de seis poços. Incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e umidade.
No dia seguinte, trate as células com o agente indutor de senescência de interesse, como o etoposídeo. Em seguida, incube por quatro dias para permitir o início da senescência. Examine as células diariamente sob um microscópio de luz para mudanças morfológicas esperadas.
Após o início da senescência, colha as células adicionando tripsina EDTA por cinco minutos a 37 graus Celsius. Quando as células estiverem dissociadas em suspensão, neutralize a tripsina com um volume igual de meio completo. Transfira cada poço de suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro.
Conte as células novamente e alíquota um número igual de células por amostra em um novo conjunto de tubos. Centrifugar os tubos durante cinco minutos a 1 000 g a quatro graus Celsius e remover o sobrenadante. Primeiro, ajuste o pH lisossômico de amostras de células cultivadas adicionando uma solução de uma bafilomicina A micromolar em DMEM ao pellet celular em uma concentração de uma vez 10 para a sexta célula por mililitro, e pipeta para misturar.
Incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius em um rotador a uma velocidade lenta. Em seguida, para corar a beta-galactosidase associada à senescência, adicione a solução-mãe de DDAOG a 10 microgramas por mililitro às amostras sem lavar. Coloque em um rotador por 60 minutos protegido da luz direta.
Como antes, centrifugar os tubos, remover o sobrenadante e lavar o pellet com um mililitro de 0,5% BSA gelado em PBS. Em seguida, adicione 300 microlitros de solução diluída de Calcein Violet 450 AM aos pellets de células lavadas. Incube por 15 minutos no gelo no escuro.
Transfira as amostras de células para tubos compatíveis com instrumentos de citometria de fluxo. No software de aquisição de dados, abra um histograma de canal violeta e um gráfico de pontos de canal vermelho distante versus canal verde. Inicie a aquisição de dados do citômetro a uma baixa velocidade de ingestão e coloque as amostras de controle positivas coradas com DDAOG na porta de admissão.
Comece a adquirir dados de exemplo. Ajuste as tensões do canal de modo que mais de 90% dos eventos estejam contidos em cada gráfico. Quando todas as configurações estiverem ótimas, registre 10.000 eventos por amostra.
Coloque as amostras de controlo apenas para veículos coradas com DDAOG na porta de admissão. Inicie a aquisição de dados e registre 10.000 eventos por amostra. Procure um aumento na autofluorescência, ou FA, e sinal DDAO-galactosídeo versus controle positivo.
Salve os dados de amostra no formato de arquivo fcs e exporte os arquivos para um computador de estação de trabalho equipado com software de análise de citometria de fluxo. Usando o software de análise de dados de citometria, carregue os arquivos de dados fcs para todas as amostras adquiridas. Primeiro, para deter células viáveis, clique duas vezes nos dados da amostra para que o controle somente do veículo abra sua janela de dados.
Visualize os dados como um histograma de canal violeta. As células viáveis coradas, coradas por CV 450, são baseadas em sua fluorescência mais brilhante do que as células mortas. Desenhe uma porta usando a ferramenta Histograma de porta única para incluir apenas células viáveis.
Nomeie o portão Viável. Em seguida, arraste a porta Viável para as outras amostras de célula da janela de layout da amostra para aplicar a porta uniformemente. Abra a janela Layout.
Na janela Layout, visualize todas as amostras como histogramas de canal violeta. Verifique se o controle celular viável é apropriado em todas as amostras. Caso contrário, ajuste conforme necessário.
Em seguida, para portar as células senescentes, clique duas vezes nos dados da célula viável fechada para que o controle somente do veículo abra sua janela de dados. Em seguida, visualize os dados como um gráfico de pontos para o canal vermelho distante versus canal verde. Desenhe uma porta usando a ferramenta Retângulo Gating para incluir menos de 5% das células DDAO-positivas e AF-positivas do quadrante superior direito.
Nomeie o portão como Senescente. Em seguida, arraste a porta Senescente para o subconjunto viável de todas as amostras da janela Layout da amostra para aplicar a porta uniformemente. Na janela Layout, arraste e solte todos os subconjuntos dependentes de células viáveis.
Visualize todas as amostras viáveis como gráficos de pontos de canal vermelho-escuro versus verde e observe os resultados. Certifique-se de que o portão senescente é visível em todas as parcelas e que o portão para os controles somente de veículo exibe menos de 5% de células senescentes. A análise está agora concluída.
Os dados agora podem ser exportados conforme desejado em formato gráfico e de tabela. Em comparação com as células não tratadas, as células senescentes de melanoma B16-F10 induzidas por etoposídeo exibiram morfologia aumentada e coloração azul devido à clivagem de X-gal por beta-galactosidase associada à senescência elevada. A coloração de células tratadas com etoposídeo com C12FDG fluorescente, ou DDAOG, demonstrou padrões de coloração e variações de intensidade comparáveis ao X-gal.
No entanto, a autofluorescência celular sobreposta com a emissão verde de C12FDG mostrou acumular-se em células senescentes não coradas. Em contraste, a autofluorescência foi tipicamente insignificante na faixa de emissão de vermelho distante do DDAOG. Configuração de aquisição de dados de citômetro de fluxo para gráficos de dispersão, microesferas comerciais de calibração fluorescente arco-íris de cinco picos e dados de fluorescência de canal único de células coradas são mostrados aqui.
Os dados do ensaio de senescência do citômetro de fluxo DDAOG para células de melanoma B16-F10 mostraram que a Senescência Induzida por Terapia, ou TIS, induzida por etoposídeo ocorreu em 35% das células viáveis, e o agente senolítico ABT-263 quase eliminou as células TIS. Nas células de câncer de pulmão A549, o TIS induzido por bleomicina em 66% das células viáveis e o ABT-263 reduziram a porcentagem para 15. O ABT-263 sozinho não foi tóxico para as células proliferantes não tratadas.
Em um ensaio de cocoloração de anticorpos, um histograma de dados do canal de EP mostrou que 42% das células tratadas com etoposídeo foram positivas para o marcador de senescência DPPP4-positivo. Além disso, a visualização com gráficos de pontos bidimensionais indicou que 44% das células tratadas com etoposídeo foram duplamente positivas para DDAOG e DPP4 versus 4% das células somente para veículos. A fixação de células coradas com DDAOG foi avaliada em seguida.
Em comparação com amostras de controle não fixas, as amostras fixas exibiram um fundo ligeiramente maior em células não tratadas, com uma porcentagem maior de células pontuando como senescentes em células tratadas com BLM. Este efeito também foi observado em amostras fixas armazenadas durante a noite e por uma semana a quatro graus Celsius. A classificação por citometria de fluxo e a validação de populações de células senescentes enriquecidas por morfologia e marcadores de proliferação são mostradas.
As células senescentes classificadas apresentaram morfologia aumentada, como esperado, visualizada pela coloração da actina com faloidina fluorescente. Uma redução no sinal para o marcador de proliferação Ki67 também foi observada pela coloração imunofluorescente. Por fim, avaliou-se a quantificação da senescência em tumores tratados com quimioterápicos.
A coloração X-gal nos tecidos foi relativamente fraca, mas a coloração azul foi evidente em tumores tratados com doxorrubicina ou doxorrubicina lipossômica peguila, particularmente em tumores que também pontuaram positivo para senescência pelo ensaio de fluxo DDAO-galactosídeo. Como esperado, os tumores somente salinos exibiram senescência insignificante. Aqui, como em qualquer ensaio de células vivas, as etapas do protocolo devem ser executadas de forma eficiente, mas suave.
Procedimentos prolongados de coloração ou incubações além dos tempos mencionados devem ser evitados. Se as células senescentes forem classificadas citometricamente em fluxo, elas podem ser colocadas de volta à cultura para imunoensaios, ou lisadas, e processadas para análise ômica, incluindo transcriptômica ou proteômica. Esta técnica permitiu que nosso laboratório e outros identificassem novas características de células tumorais senescentes, incluindo quantificação de danos ao DNA, expressão de proteínas e mudanças no metabolismo.
