Sonde β-galactosidase associée à la sénescence fluorescente rouge lointain pour l’identification et l’enrichissement de cellules tumorales sénescentes par cytométrie en flux

Notre protocole de cytométrie en flux multiparamétrique permet une détection rapide et améliorée de la sénescence induite par le traitement dans les cellules tumorales, qui est une condition de l’étude en cours en biologie et en thérapie du cancer. Notre test de sénescence par cytométrie en flux est plus rapide que les tests de microscopie existants. Nous utilisons deux marqueurs, au lieu d’un seul, pour identifier les cellules sénescentes, améliorant ainsi la fiabilité du test.

Les cellules peuvent être co-colorées avec des anticorps fluorescents pour détecter d’autres cibles d’intérêt. Le tri par cytométrie de flux peut être utilisé pour enrichir les populations de cellules sénescentes pour l’analyse en aval. Le test peut détecter des cellules sénescentes dans des lignées cellulaires cancéreuses en culture ou dans des échantillons de tumeurs entières après une dissociation douce.

Avant d’essayer cette technique, il est important de se familiariser avec les procédures opératoires générales du cytomètre en flux utilisé. Veuillez consulter le texte pour connaître les spécifications recommandées du cytomètre en flux. Un jour avant l’induction de la sénescence par des médicaments, récoltez la culture de lignée cellulaire cancéreuse avec 0,25% de trypsine EDTA.

Placez les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes pour activer la trypsine et détachez la monocouche cellulaire. Lorsque la monocouche s’est visiblement détachée, neutraliser la trypsine en ajoutant un volume égal de milieu de culture complet. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique stérile.

Comptez les cellules à l’aide de la méthode standard de l’hémocytomètre et enregistrez les cellules par millilitre. Cellules de plaque à une fois 10 à la troisième à 10 fois 10 à la troisième cellules par centimètre carré dans une plaque de culture en plastique standard à six puits. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et d’humidité.

Le lendemain, traitez les cellules avec l’agent induisant la sénescence d’intérêt, tel que l’étoposide. Puis incuber pendant quatre jours pour permettre l’apparition de la sénescence. Examiner les cellules quotidiennement au microscope optique pour détecter les changements morphologiques prévus.

Après le début de la sénescence, récoltez les cellules en ajoutant de la trypsine EDTA pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules sont dissociées en suspension, neutraliser la trypsine avec un volume égal de milieu complet. Transférer chaque puits de suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,7 millilitre.

Comptez à nouveau les cellules et aliquotez un nombre égal de cellules par échantillon dans un nouvel ensemble de tubes. Centrifuger les tubes pendant cinq minutes à 1 000 g à quatre degrés Celsius et retirer le surnageant. Tout d’abord, ajuster le pH lysosomal des échantillons de cellules cultivées en ajoutant une solution d’une micromolaire de bafilomycine A dans DMEM à la pastille cellulaire à une concentration d’une fois 10 à la sixième cellule par millilitre, et pipette à mélanger.

Incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius sur un rotateur à faible vitesse. Ensuite, pour colorer la bêta-galactosidase associée à la sénescence, ajouter la solution mère DDAOG à 10 microgrammes par millilitre aux échantillons sans lavage. Placer sur un rotateur pendant 60 minutes à l’abri de la lumière directe.

Comme précédemment, centrifugez les tubes, retirez le surnageant et lavez la pastille avec un millilitre de glaçon à 0,5% de BSA dans du PBS. Ajoutez ensuite 300 microlitres de solution diluée de Calcein Violet 450 AM aux granulés de cellules lavées. Incuber pendant 15 minutes sur de la glace dans l’obscurité.

Transférer les échantillons cellulaires dans des tubes compatibles avec les instruments de cytométrie en flux. Dans le logiciel d’acquisition de données, ouvrez un histogramme de canal violet et un diagramme à points de canal rouge lointain par rapport au canal vert. Initier l’acquisition des données du cytomètre à une faible vitesse d’admission et placer les échantillons témoins positifs colorés avec DDAOG sur l’orifice d’admission.

Commencez à acquérir des exemples de données. Ajustez les tensions de canal de sorte que plus de 90 % des événements soient contenus dans chaque graphique. Lorsque tous les paramètres sont optimaux, enregistrez 10 000 événements par échantillon.

Placez les échantillons de contrôle du véhicule uniquement colorés au DDAOG sur l’orifice d’admission. Lancez l’acquisition de données et enregistrez 10 000 événements par échantillon. Recherchez une augmentation de l’autofluorescence, ou AF, et du signal DDAO-galactoside par rapport au contrôle positif.

Enregistrez les données de l’échantillon au format de fichier fcs et exportez-les vers un poste de travail équipé d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux. À l’aide d’un logiciel d’analyse de données de cytométrie, chargez les fichiers de données fcs pour tous les échantillons acquis. Tout d’abord, pour ouvrir les cellules viables, double-cliquez sur les données d’échantillon pour le contrôle du véhicule uniquement pour ouvrir sa fenêtre de données.

Visualisez les données sous forme d’histogramme à canal violet. Les cellules viables colorées, colorées par CV 450, sont basées sur leur fluorescence plus brillante que les cellules mortes. Dessinez une porte à l’aide de l’outil Histogramme à porte unique pour inclure uniquement les cellules viables.

Nommez la porte Viable. Faites ensuite glisser la porte Viable sur les autres échantillons de cellules à partir de la fenêtre de disposition de l’exemple pour appliquer la porte uniformément. Ouvrez la fenêtre Mise en page.

Dans la fenêtre Mise en page, visualisez tous les échantillons sous forme d’histogrammes à canal violet. Vérifier que le contrôle cellulaire viable est approprié pour tous les échantillons. Si ce n’est pas le cas, ajustez au besoin.

Ensuite, pour ouvrir les cellules sénescentes, double-cliquez sur les données de cellule viable fermées pour que le contrôle du véhicule uniquement ouvre sa fenêtre de données. Ensuite, visualisez les données sous forme de diagramme à points pour le canal rouge lointain par rapport au canal vert. Dessinez une porte à l’aide de l’outil Rectangle de contrôle pour inclure moins de 5 % de cellules DDAO positives et AF positives du quadrant supérieur droit.

Nommez la porte comme Sénescente. Faites ensuite glisser la porte Senescent sur le sous-ensemble viable de tous les exemples de la fenêtre Exemple de disposition pour appliquer la porte uniformément. Dans la fenêtre Mise en page, faites glisser et déposez tous les sous-ensembles viables de cellules fermées.

Visualisez tous les échantillons viables sous forme de diagrammes à points de canaux rouges et verts et observez les résultats. S’assurer que la barrière sénescente est visible sur toutes les parcelles et que la barrière des commandes réservées aux véhicules présente moins de 5 % de cellules sénescentes. L’analyse est maintenant terminée.

Les données peuvent maintenant être exportées comme vous le souhaitez sous forme graphique et de tableau. Par rapport aux cellules non traitées, les cellules de mélanome sénescentes B16-F10 induites par l’étoposide présentaient une morphologie élargie et une coloration bleue due au clivage de X-gal par une bêta-galactosidase associée à la sénescence élevée. La coloration des cellules traitées à l’étoposide avec du C12FDG fluorescent, ou DDAOG, a montré des modèles de coloration et des variations d’intensité comparables à X-gal.

Cependant, il a été démontré que l’autofluorescence cellulaire chevauchant l’émission verte de C12FDG s’accumulait dans les cellules sénescentes non colorées. En revanche, l’autofluorescence était généralement négligeable dans la gamme d’émission rouge lointain de DDAOG. La configuration d’acquisition des données du cytomètre en flux pour les nuages de points, les microsphères commerciales d’étalonnage fluorescent arc-en-ciel à cinq pics et les données de fluorescence à canal unique provenant de cellules colorées sont présentées ici.

Les données du test de sénescence du cytomètre en flux DDAOG pour les cellules de mélanome B16-F10 ont montré que la sénescence induite par le traitement, ou TIS, induite par l’étoposide s’est produite dans 35% des cellules viables, et l’agent sénolytique ABT-263 a presque éliminé les cellules TIS. Dans les cellules cancéreuses du poumon A549, le TIS induit par la bléomycine dans 66% des cellules viables et ABT-263 a réduit le pourcentage à 15. ABT-263 seul n’était pas toxique pour les cellules proliférantes non traitées.

Dans un test de co-coloration d’anticorps, un histogramme des données du canal PE a montré que 42% des cellules traitées à l’étoposide étaient positives pour le marqueur de sénescence DPPP4-positif. De plus, la visualisation à l’aide de diagrammes à points bidimensionnels a indiqué que 44 % des cellules traitées à l’étoposide étaient doublement positives pour le DDAOG et le DPP4 contre 4 % des cellules véhicule. La fixation des cellules colorées DDAOG a ensuite été évaluée.

Par rapport aux échantillons témoins non fixés, les échantillons fixes présentaient un fond légèrement plus élevé dans les cellules non traitées, avec un pourcentage plus élevé de cellules sénescentes dans les cellules traitées par BLM. Cet effet a également été observé dans des échantillons fixes stockés pendant la nuit et pendant une semaine à quatre degrés Celsius. Le tri par cytométrie de flux et la validation des populations de cellules sénescentes enrichies par morphologie et marqueurs de prolifération sont présentés.

Les cellules sénescentes triées présentaient une morphologie élargie, comme prévu, visualisée par coloration de l’actine avec de la phalloïdine fluorescente. Une réduction du signal du marqueur de prolifération Ki67 a également été observée par coloration par immunofluorescence. Enfin, la quantification de la sénescence dans les tumeurs traitées avec des médicaments de chimiothérapie a été évaluée.

La coloration X-gal dans les tissus était relativement faible, mais la coloration bleue était évidente dans les tumeurs traitées par doxorubicine, ou doxorubicine liposomale pégylée, en particulier dans les tumeurs qui ont également obtenu un score positif pour la sénescence par test de flux DDAO-galactoside. Comme prévu, les tumeurs salines présentaient une sénescence négligeable. Ici, comme pour tout test de cellule vivante, les étapes du protocole doivent être effectuées efficacement, mais en douceur.

Les procédures de coloration prolongées ou les incubations au-delà des temps mentionnés doivent être évitées. Si les cellules sénescentes sont triées cytométriquement en flux, elles peuvent être remises en culture pour des immunoessais, ou lysées, et traitées pour l’analyse omique, y compris la transcriptomique ou la protéomique. Cette technique a permis à notre laboratoire et à d’autres d’identifier de nouvelles caractéristiques des cellules tumorales sénescentes, y compris la quantification des dommages à l’ADN, l’expression des protéines et les changements dans le métabolisme.