당사의 다중 매개변수 유세포분석 프로토콜은 암 생물학 및 치료 분야에서 지속적인 연구 조건인 종양 세포에서 치료 유발 노화의 신속하고 향상된 검출을 가능하게 합니다. 당사의 유세포분석 노화 분석은 기존의 현미경 기반 분석보다 더 빠릅니다. 우리는 노화 세포를 식별하기 위해 하나가 아닌 두 개의 마커를 사용하여 분석 신뢰성을 향상시킵니다.
세포를 형광 항체로 공동 염색하여 관심있는 추가 표적을 검출 할 수 있습니다. 유세포분석 분류는 다운스트림 분석을 위해 노화 세포의 집단을 풍부하게 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석은 배양된 암 세포주 또는 부드러운 해리 후 전체 종양 샘플에서 노화 세포를 검출할 수 있습니다.
이 기술을 시도하기 전에 사용되는 유세포 분석기의 일반적인 작동 절차를 숙지하는 것이 중요합니다. 권장 유세포분석기 사양에 대해서는 텍스트를 참조하십시오. 약물에 의한 노화 유도 하루 전에 0.25% 트립신 EDTA로 암 세포주 배양을 수확합니다.
세포를 섭씨 37도에 5 분 동안 두어 트립신을 활성화하고 세포 단층을 분리합니다. 단층이 눈에 띄게 분리되면 동일한 부피의 완전한 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다. 세포 현탁액을 멸균 원추형 튜브로 옮깁니다.
표준 혈구계 방법을 사용하여 세포를 계수하고 밀리리터당 세포를 기록합니다. 세포를 표준 6-웰 플라스틱 배양 플레이트에서 평방 센티미터당 10 내지 10번 내지 10번 내지 10번 세포를 플레이트화한다. 접시를 섭씨 37도에서 5%이산화탄소와 습도로 밤새 배양합니다.
다음날, 세포를 에토포사이드와 같은 관심있는 노화 유도제로 처리한다. 그런 다음 노화가 시작될 수 있도록 4 일 동안 배양하십시오. 예상되는 형태 변화에 대해 광학 현미경으로 매일 세포를 검사합니다.
노화가 시작된 후 트립신 EDTA를 섭씨 37도에서 5 분 동안 첨가하여 세포를 수확합니다. 세포가 현탁액으로 해리되면 동일한 부피의 완전한 배지로 트립신을 중화시킵니다. 세포 현탁액의 각 웰을 1.7밀리리터 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
세포를 다시 세고 샘플당 동일한 수의 세포를 새 튜브 세트로 분취합니다. 튜브를 섭씨 4도에서 1, 000g에서 5 분간 원심 분리하고 상층액을 제거하십시오. 먼저, DMEM에 바필로마이신 A 마이크로몰 1개의 용액을 세포 펠렛에 첨가하여 배양된 세포 시료의 리소좀 pH를 밀리리터당 10배 내지 6배의 농도로 첨가하고 피펫으로 혼합한다.
회전 장치에서 섭씨 37도에서 느린 속도로 30 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 노화 관련 베타-갈락토시다아제를 염색하려면 세척하지 않고 밀리리터당 10마이크로그램의 DDAOG 원액을 샘플에 추가합니다. 직사광선이 비치지 않도록 60분 동안 회전 장치에 두십시오.
이전과 같이 튜브를 원심 분리하고 상청액을 제거한 다음 PBS에서 얼음처럼 차가운 0.5 % BSA 1 밀리리터로 펠릿을 씻습니다. 그런 다음 300 마이크로 리터의 희석 된 Calcein Violet 450 AM 용액을 세척 된 세포 펠릿에 첨가하십시오. 어둠 속에서 얼음 위에서 15 분 동안 배양하십시오.
세포 샘플을 유세포분석 기기 호환 튜브로 옮깁니다. 데이터 수집 소프트웨어에서 보라색 채널 히스토그램과 원적색 채널 대 녹색 채널 도트 플롯을 엽니다. 낮은 흡기 속도에서 세포분석기 데이터 수집을 시작하고 DDAOG로 염색된 양성 대조군 샘플을 흡기 포트에 놓습니다.
샘플 데이터 수집을 시작합니다. 각 플롯 내에 90% 이상의 이벤트가 포함되도록 채널 전압을 조정합니다. 모든 설정이 최적이면 샘플당 10, 000개의 이벤트를 기록합니다.
DDAOG로 염색된 차량 전용 제어 샘플을 흡기 포트에 놓습니다. 데이터 수집을 시작하고 샘플당 10, 000개의 이벤트를 기록합니다. 양성 대조군과 비교하여 자가형광 또는 AF 및 DDAO-갈락토사이드 신호의 증가를 확인하십시오.
샘플 데이터를 fcs 파일 형식으로 저장하고 유세포 분석 소프트웨어가 장착 된 워크 스테이션 컴퓨터로 파일을 내 보냅니다. 세포 분석 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 획득 한 모든 샘플에 대한 fcs 데이터 파일을로드합니다. 먼저 생존 가능한 셀을 게이트하려면 차량 전용 컨트롤의 샘플 데이터를 두 번 클릭하여 데이터 창을 엽니다.
데이터를 보라색 채널 히스토그램으로 시각화합니다. CV 450으로 염색 된 생존 세포는 죽은 세포보다 더 밝은 형광을 기반으로합니다. 단일 게이트 히스토그램 도구를 사용하여 실행 가능한 셀만 포함하도록 게이트를 그립니다.
게이트의 이름을 실행 가능하게 지정합니다. 그런 다음 Viable 게이트를 샘플 레이아웃 창에서 다른 셀 샘플로 끌어 게이트를 균일하게 적용합니다. 레이아웃 창을 엽니다.
레이아웃 창에서 모든 샘플을 보라색 채널 히스토그램으로 시각화합니다. 생존 가능한 세포 게이팅이 샘플 간에 적절한지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 필요에 따라 조정하십시오.
다음으로, 노화 셀을 게이트하려면 차량 전용 컨트롤에 대한 제어된 실행 가능한 셀 데이터를 두 번 클릭하여 데이터 창을 엽니다. 그런 다음 데이터를 원적외선 채널 대 녹색 채널에 대한 점도표로 시각화합니다. 사각형 게이팅 도구를 사용하여 오른쪽 위 사분면에서 DDAO 양성 및 AF 양성 셀이 5% 미만인 게이트를 그립니다.
게이트의 이름을 노인으로 지정합니다. 그런 다음 Senescent 게이트를 샘플 레이아웃 창에서 모든 샘플의 실행 가능한 하위 집합으로 끌어 게이트를 균일하게 적용합니다. 레이아웃 창으로 실행 가능한 모든 셀 게이트 하위 집합을 끌어다 놓습니다.
실행 가능한 모든 샘플을 원적색 대 녹색 채널 점도표로 시각화하고 결과를 관찰합니다. 노화 게이트가 모든 플롯에서 보이고 차량 전용 제어장치의 게이트가 5% 미만의 노화 셀을 나타내는지 확인합니다. 이제 분석이 완료되었습니다.
이제 데이터를 그래픽 및 표 형식으로 원하는 대로 내보낼 수 있습니다. 처리되지 않은 세포와 비교하여 에토포사이드에 의해 유도된 노화 B16-F10 흑색종 세포는 노화 관련 베타-갈락토시다아제 상승에 의한 X-gal의 절단으로 인해 확대된 형태 및 청색 염색을 나타냈습니다. 형광 C12FDG 또는 DDAOG로 에토포사이드 처리된 세포의 염색은 X-gal과 유사한 염색 패턴 및 강도 변화를 보여주었습니다.
그러나, 녹색 C12FDG 방출과 겹치는 세포 자가형광은 염색되지 않은 노화 세포에서 축적되는 것으로 나타났다. 대조적으로, 자가형광은 DDAOG의 원적색 방출 범위에서 전형적으로 무시할 수 있었다. 산점도에 대한 유세포분석기 데이터 수집 설정, 5피크 상용 무지개 형광 보정 마이크로스피어 및 염색된 세포의 단일 채널 형광 데이터가 여기에 표시됩니다.
B16-F10 흑색종 세포에 대한 DDAOG 유세포분석기 노화 분석 데이터는 에토포사이드에 의해 유도된 치료 유도 노화(TIS)가 생존 세포의 35%에서 발생했으며 세놀리틱 에이전트 ABT-263이 TIS 세포를 거의 제거했음을 보여주었습니다. A549 폐암 세포에서 블레오마이신은 생존 세포의 66 %에서 TIS를 유도했으며 ABT-263은 그 비율을 15로 감소시켰다. ABT-263 단독은 처리되지 않은 증식 세포에 독성이 없었습니다.
항체 공동 염색 분석에서 PE 채널 데이터의 히스토그램은 에토포사이드 처리된 세포의 42%가 노화 마커 DPPP4 양성에 대해 양성인 것으로 나타났습니다. 또한 2차원 점도를 사용한 시각화에 따르면 에토포사이드 처리된 세포의 44%가 DDAOG 및 DPP4에 대해 이중 양성인 반면 비히클 전용 세포의 경우 4%가 양성이었습니다. 다음으로 DDAOG 염색된 세포의 고정을 평가하였다.
고정되지 않은 대조군 샘플과 비교하여, 고정 샘플은 BLM-처리된 세포에서 노화로 점수가 더 높은 세포의 비율이 더 높은 미처리 세포에서 약간 더 높은 배경을 나타냈다. 이 효과는 밤새 보관된 고정 샘플에서도 관찰되었으며, 섭씨 4도에서 1주일 동안 보관되었습니다. 형태학 및 증식 마커에 의한 농축된 노화 세포 집단의 유세포분석 분류 및 검증이 표시됩니다.
분류된 노화 세포는 예상대로 액틴을 형광 팔로이딘으로 염색하여 시각화된 확대된 형태를 나타냈습니다. 증식 마커 Ki67에 대한 신호의 감소를 또한 면역형광 염색에 의해 관찰하였다. 마지막으로, 화학 요법 약물로 치료 한 종양에서 노화의 정량화가 평가되었다.
조직의 X-gal 염색은 상대적으로 약했지만 독소루비신 또는 페길화 리포좀 독소루비신으로 치료한 종양, 특히 DDAO-갈락토사이드 흐름 분석에 의해 노화에 대해 양성 점수를 받은 종양에서 청색 염색이 분명했습니다. 예상대로, 식염수 전용 종양은 무시할 수있는 노화를 나타 냈습니다. 여기에서 모든 라이브 셀 분석과 마찬가지로 프로토콜 단계는 효율적이지만 부드럽게 수행되어야 합니다.
장기간의 염색 절차 또는 언급 된 시간을 초과하는 배양은 피해야합니다. 노화 세포가 유세포 분석기로 분류되면 면역 분석을 위해 배양물에 다시 넣거나 용해하고 전사체학 또는 단백질체학을 포함한 오믹스 분석을 위해 처리할 수 있습니다. 이 기술을 통해 우리 실험실과 다른 사람들은 DNA 손상, 단백질 발현 및 신진 대사 변화의 정량화를 포함하여 노화 종양 세포의 새로운 특징을 식별 할 수있었습니다.
