私たちのプロトコルは、感染中に起こる微生物相互作用の空間代謝の可視化を可能にします。このイメージング質量分析ワークフローは、寒天および組織モデルで増殖させた細菌共培養用に開発されました。寒天上で増殖した細菌培養物などの非伝統的な基質の分析には、多くの課題があります。
当社のプロトコルを使用すると、細菌検体を適切に乾燥させて、その後のイメージング質量分析でのMALDIマトリックスの適用を容易にすることができます。この方法は、さまざまな代謝物、微生物病原体または疾患、および細胞または組織の生化学の空間的測定が望まれるサンプルタイプ、特に分析前に脱水を必要とするサンプルタイプを研究する場合に広く適用できます。細菌培養マクロコロニーを調製した後、ITOコーティングされた顕微鏡スライドにマウントされたアガロース細菌コロニーを包装材料から取り出します。
サンプルを乾燥剤の入ったドライボックスに室温で48〜72時間入れます。寒天表面の変形についてコロニーを目視検査します。次に、サンプルチャンバーへの真空ラインを閉じ、ロータリーベーンポンプの電源スイッチをオンにして、真空ポンプを暖め、適切な真空圧を達成します。
可変電圧変圧器をオンにして、チャンバーに巻き付けられたワイヤーフィラメントを加熱します。真空チャンバーの内部温度が摂氏約50度に達するまで、可変電源を調整します。ポンプがウォームアップしている間に、ドライアイスと100%エタノールのスラリーをコールドトラップコンデンサーに入れます。
レンチを使用して真空チャンバーを開き、16ミリメートルのダブルクロスフランジクランプを緩めます。アガロースサンプルをチャンバーに挿入し、16ミリメートルのダブルクロスフランジクランプでチャンバーをしっかりと密閉します。次に、ポンプバルブを開いてチャンバーを排出し、サンプルを60〜120分間乾燥させます。
完了したら、ロータリーベーンポンプのバルブを閉じ、真空フランジを周囲空気に開放して、真空チャンバーをゆっくりと周囲圧力に通気します。前述のようにチャンバーを開き、乾燥したアガロースサンプルをチャンバーから取り出します。1,5-ジアミノナフタレンMALDIマトリックスを使用して、アミノ酸の良好な脱離とイオン化、およびマイナスイオンモードを実現します。
サンプルを噴霧器トレイに取り付け、調製した溶液を噴霧器ラインに装填します。コンピュータソフトウェアを使用して、マトリックス化合物の均一なコーティングに必要なパラメータを指定します。終了するまでスプレーシーケンスを監視します。
噴霧器トレイからサンプルを取り出し、分析するまで乾燥キャビネットに保管します。マトリックスコーティングされたサンプルをMALDIターゲットプレート顕微鏡スライドアダプターに挿入します。永久マーカーを使用して、サンプル領域を囲む少なくとも3つの基準マーカーを刻みます。
フラットベッドスキャナーを使用して、受託者マーカーを含む顕微鏡スライドの光学画像を取得します。次に、原稿に記載されている質量分析装置法を定義します。負イオンモードでは、目的の代謝物の電荷値による質量を含む選択されたイオンの連続蓄積アプローチを使用して、気相シグナル濃縮のために、電荷による質量100から200までの100ダルトン質量ウィンドウを選択します。
機器の画像集録ソフトウェアを開き、セットアップウィザードを使用して、ファイル名と場所、MS集録モード、サンプリングする関心領域、画像の空間分解能を定義します。光学画像の基準マーカーを使用してサンプルをティーチし、機器のサンプルキャリアと同期させます。次に、ソフトウェアの関心領域選択ツールを使用して、光学画像の関心領域を定義します。
すべてのパラメータを定義したら、アクイジションシーケンスを開始して、定義された関心領域全体の各ピクセルでマススペクトルをシリアルにアクイジションします。画像取得後、イメージング質量分析プラットフォーム用のベンダー固有のファイル形式であるMISファイル拡張子でデータを保存します。FlexImagingまたはSCiLSソフトウェアパッケージでデータファイルを開くか、mzMLなどの非独占的なデータ形式にエクスポートし、ベンダーに依存しないソフトウェアを使用して視覚化します。
リファレンスソフトウェアを使用して、対象となるピークのマスウィンドウを定義し、サンプリングされた領域全体のイオン分布の偽カラーヒートマップを生成します。平均マススペクトル表示で、目的のピークにズームインし、ピークプロファイルの領域を含む適切なマスウィンドウを選択します。次に、強調表示されたマスウィンドウを右クリックし、[マスフィルタを追加]を選択します。
高解像度の正確な質量測定によって決定された疑わしい代謝物の暫定的な識別を使用して、電荷値によって選択した質量をラベル付けします。.強度しきい値を選択して、偽カラーヒートマップによって表示される分析種画像のダイナミックレンジを調整します。マス フィルター パラメーターをさらに調整して、マス ウィンドウがピーク プロファイルの領域を含むようにしてから、質量フィルターを追加します。
すべての凍結切片装置を100%エタノールですすぎ、乾燥させてからサンプルをクライオスタットチャンバーに入れます。抵抗計を使用してITOコーティングされた顕微鏡スライドを準備し、導電性コーティングでスライドの側面を識別します。先端がダイヤモンドのスクライブを使用して、顕微鏡スライドのITOコーティングされた面をエッチングしてラベルを付けます。
次に、研究用クライオミクロトームで凍結切片を実行します。OCTを埋め込んだマウスのセカ組織を摂氏80度の冷凍庫からドライアイス上のクライオミクロトームチャンバーに移します。クライオミクロトームチャンバー内で、追加のOCT溶液を使用して、OCT埋め込み組織をサンプルチャックに取り付けます。
OCT溶液が固まったら、チャックを検体ヘッドに固定し、10〜50マイクロメートル刻みで凍結切片を開始して、臓器の目的の組織の深さまたは平面に到達します。組織の最適な断面に達したら、12マイクロメートルの厚さで切片の収集を開始します。アーティストのペイントブラシを使用してスライスをそっと操作し、テフロンコーティングされた顕微鏡スライドに配置します。
テフロンコーティングされたスライドから組織をピックアップするには、ITOコーティングされた顕微鏡スライドを組織切片の上に転がします。手のひらをITOコーティングされたスライドの背面に押し付けて、組織切片を顕微鏡スライドに解凍マウントします。組織切片が半透明から不透明またはマットなテクスチャに移行するまで、解凍マウントを続けます。
同日分析のために、ドライアイス上の組織に取り付けられた顕微鏡スライドを乾燥剤の入ったドライボックスに移して保管します。前述のように、MALDIマトリックスアプリケーションとMALDIイメージング質量分析を実行します。複数の生物学的複製からのイオン画像を解析し、SCiLS統計ソフトウェアを使用した強度箱ひげ図比較により有意性の結果を比較する。
細菌培養サンプルのマイナスイオンモードMALDI分析により、数十の代謝物を検出できます。高分解能の正確な質量測定により、オルニチンとアルギニンの暫定的な同定が可能になります。イメージング質量分析のための測定領域を示す。
これらのサンプルのイメージング質量分析により、エンテロコッカス・フェカリスの存在下で変化し、差次的に局在することが判明したオルニチンとアルギニンの両方のアミノ酸代謝物の空間マッピングが可能になります。感染したマウスcecaの組織形態をヘマトキシリンおよびエオジン染色を用いて可視化した。1,5−ジアミノナフタレンMALDIマトリックス層を適用した後のマウス盲腸組織の光学像を示す。
オルニチンとアルギニンのMALDIイオン画像は、組織サンプル全体に独自の空間分布を示しています。このプロトコルの最も重要な考慮事項は、細菌培養標本の穏やかな乾燥と取り扱いを維持し、サンプルのバブリング、ひび割れ、およびその他の変形を最小限に抑えることです。イメージング質量分析に続いて、組織サンプルの明視野および蛍光顕微鏡分析を実行して、組織の形態を評価できます。
これにより、抗体ベースのイメージング法を使用した分子経路の標的検証も可能になります。
