Nuestro protocolo permite la visualización del metabolismo espacial de las interacciones microbianas que ocurren durante la infección. Hemos desarrollado este flujo de trabajo de espectrometría de masas de imágenes para cocultivos bacterianos cultivados en modelos de agar y tejidos. El análisis de sustratos no tradicionales, como los cultivos bacterianos cultivados en agar, presenta muchos desafíos.
Usando nuestro protocolo, las muestras bacterianas se pueden secar adecuadamente para facilitar la aplicación de la matriz MALDI en el posterior análisis de espectrometría de masas de imágenes. Este método es ampliamente aplicable a una variedad de metabolitos, patógenos microbianos o enfermedades, y tipos de muestras donde se desea una medida espacial de la bioquímica celular o tisular, particularmente cuando se estudian tipos de muestras que requieren deshidratación antes del análisis. Después de preparar las macrocolonias de cultivo bacteriano, retire las colonias bacterianas de agarosa montadas en portaobjetos de microscopio recubiertos con ITO del material de embalaje.
Coloque las muestras en una caja seca con desecante durante 48 a 72 horas a temperatura ambiente. Inspeccione visualmente las colonias en busca de deformaciones en la superficie del agar. A continuación, cierre la línea de vacío a la cámara de muestras y encienda el interruptor de encendido de la bomba de paletas rotativas para permitir que la bomba de vacío se caliente y logre la presión de vacío adecuada.
Encienda el transformador de voltaje variable para calentar el filamento de alambre envuelto alrededor de la cámara. Ajuste la fuente de alimentación variable hasta que la temperatura interna de la cámara de vacío alcance aproximadamente 50 grados centígrados. Mientras la bomba se calienta, coloque una suspensión de hielo seco y 100% de etanol en el condensador de trampa fría.
Abra la cámara de vacío con una llave inglesa para aflojar las abrazaderas de brida de tela doble de 16 milímetros. Inserte las muestras de agarosa en la cámara y selle la cámara herméticamente con las abrazaderas de brida de tela doble de 16 milímetros. Luego abra la válvula de la bomba para evacuar la cámara y deje que las muestras se sequen durante 60 a 120 minutos.
Cuando haya terminado, ventile lentamente la cámara de vacío a la presión ambiente cerrando la válvula de la bomba de paletas rotativas y abriendo la brida de vacío al aire ambiente. Abra la cámara como se demostró anteriormente y retire la muestra de agarosa seca de la cámara. Utilice la matriz MALDI de 1,5-Diaminonaftaleno para su desorción e ionización favorable de aminoácidos y modo de iones negativos.
Fije la muestra a la bandeja del pulverizador y cargue las soluciones preparadas en la línea del pulverizador. Usando el software de computadora, especifique los parámetros necesarios para un recubrimiento uniforme del compuesto de matriz. Controle la secuencia de pulverización hasta que finalice.
Retire la muestra de la bandeja del pulverizador y guárdela en un gabinete de desecación hasta el análisis. Inserte la muestra recubierta de matriz en el adaptador de portaobjetos del microscopio de placa diana MALDI. Inscriba al menos tres marcadores fiduciarios que abarquen el área de muestra utilizando marcadores permanentes.
Utilice un escáner plano para adquirir una imagen óptica del portaobjetos del microscopio, incluidos los marcadores fiduciarios. Ahora defina un método de instrumento de espectrometría de masas como se describe en el manuscrito. En el modo de iones negativos, seleccione la ventana de masa de 100 dalton de masa por carga 100 a 200 para el enriquecimiento de la señal en fase gaseosa utilizando un enfoque de acumulación continua de iones seleccionados que abarca los valores de masa por carga de los metabolitos de interés.
Abra el software de adquisición de imágenes del instrumento y utilice el asistente de configuración para definir el nombre y la ubicación del archivo, el modo de adquisición de MS, las regiones de interés que se muestrearán y la resolución espacial de la imagen. Enseñe la muestra utilizando los marcadores fiduciarios de la imagen óptica para sincronizarla con el portador de la muestra del instrumento. A continuación, defina las regiones de interés en la imagen óptica utilizando la herramienta de selección de regiones de interés del software.
Una vez que se hayan definido todos los parámetros, inicie la secuencia de adquisición para adquirir en serie un espectro de masas en cada píxel a través de la región de interés definida. Después de la adquisición de imágenes, guarde los datos con una extensión de archivo MIS, que es un formato de archivo específico del proveedor para plataformas de espectrometría de masas de imágenes. Abra el archivo de datos en paquetes de software flexImaging o SCiLS, o expórtelo a un formato de datos no propietario, como mzML, y visualícelo con un software independiente del proveedor.
Usando el software de referencia, defina ventanas de masa para picos de interés para generar mapas de calor en color falsos de distribuciones de iones en las regiones muestreadas. En la pantalla del espectro de masas promedio, amplíe el pico de interés y seleccione una ventana de masa adecuada que abarque el área del perfil del pico. Ahora, haga clic derecho en la ventana de masa resaltada y seleccione Agregar filtro de masa.
Etiquete la masa seleccionada por el valor de carga utilizando la identificación tentativa del metabolito sospechoso según lo determinado por la medición de masa precisa de alta resolución. Seleccione el umbral de intensidad para ajustar el rango dinámico de la imagen del analito mostrada por el mapa de calor de color falso. Ajuste aún más los parámetros de filtrado de masa para que la ventana de masa abarque el área del perfil de pico y, a continuación, agregue el filtro de masa.
Limpie todo el equipo de criosección enjuagándolo con etanol al 100% y deje secar antes de colocar muestras en la cámara de criostato. Prepare portaobjetos de microscopio recubiertos con ITO utilizando un ohmímetro para identificar el lado del portaobjetos con el recubrimiento conductor. Usando un escriba con punta de diamante, grabe y etiquete el lado recubierto ITO del portaobjetos del microscopio.
Luego realice la criosección en un criomicrótomo de investigación. Transfiera los tejidos de ceca de ratón incrustados en OCT de un congelador de 80 grados centígrados a la cámara de criomicrotomo en hielo seco. Dentro de la cámara de criomicrotomo, monte el tejido incrustado en OCT en un mandril de muestra con una solución OCT adicional.
Después de que la solución OCT se haya solidificado, fije el mandril a la cabeza de la muestra y comience la criosección en incrementos de 10 a 50 micrómetros para alcanzar la profundidad o el plano de tejido deseado del órgano. Una vez que se alcanza una sección transversal óptima del tejido, comience a recolectar secciones a 12 micrómetros de espesor. Manipule suavemente la rebanada con pinceles de artista y colóquela en un portaobjetos de microscopio recubierto de teflón.
Para recoger el tejido del portaobjetos recubierto de teflón, enrolle el portaobjetos del microscopio recubierto con ITO sobre la sección de tejido. Descongele la sección de tejido en el portaobjetos del microscopio presionando la palma de la mano en la parte posterior del portaobjetos recubierto con ITO. Continúe descongelando hasta que la sección de tejido pase de translúcida a una textura opaca o mate.
Para el análisis el mismo día, transfiera los portaobjetos de microscopio montados en tejido sobre hielo seco a una caja seca con desecante para su almacenamiento. Realice la aplicación de matriz MALDI y la espectrometría de masas de imágenes MALDI como se demostró anteriormente. Analice las imágenes de iones de múltiples réplicas biológicas y compare los resultados para una significación a través de comparaciones de diagramas de caja de intensidad utilizando el software estadístico SCiLS.
El análisis MALDI en modo de iones negativos de muestras de cultivo bacteriano permite detectar docenas de metabolitos. Las mediciones de masa precisas de alta resolución permiten la identificación tentativa de ornitina y arginina. Se muestran las regiones de medición para el análisis de espectrometría de masas de imágenes.
La espectrometría de masas de imágenes de estas muestras permite el mapeo espacial de los metabolitos de aminoácidos de ornitina y arginina que se encuentran alterados y localizados diferencialmente en presencia de Enterococcus faecalis. La morfología tisular de la ceca del ratón infectado se visualizó mediante tinción con hematoxilina y eosina. Se muestran imágenes ópticas de tejidos de ceca de ratón después de aplicar una capa de matriz MALDI de 1, 5-diaminonaftaleno.
Las imágenes de iones MALDI para ornitina y arginina muestran distribuciones espaciales únicas en las muestras de tejido. La consideración más importante para este protocolo es mantener un secado y manejo suaves de las muestras de cultivo bacteriano para minimizar el burbujeo, el agrietamiento y otras deformaciones de la muestra. Después de la espectrometría de masas de imágenes, se pueden realizar análisis de microscopía de campo claro y fluorescencia de muestras de tejido para evaluar la morfología del tejido.
Esto también puede permitir la validación dirigida de vías moleculares utilizando métodos de imagen basados en anticuerpos.
