Protokolümüz, enfeksiyon sırasında meydana gelen mikrobiyal etkileşimlerin mekansal metabolizmasının görselleştirilmesini sağlar. Bu görüntüleme kütle spektrometresi iş akışını, agar ve doku modellerinde yetiştirilen bakteriyel ko-kültürler için geliştirdik. Agar üzerinde yetiştirilen bakteri kültürleri gibi geleneksel olmayan substratları analiz etmek birçok zorluk ortaya koymaktadır.
Protokolümüzü kullanarak, bakteri örnekleri, sonraki görüntüleme kütle spektrometrisi analizinde MALDI matris uygulamasını kolaylaştırmak için uygun şekilde kurutulabilir. Bu yöntem, çeşitli metabolitlere, mikrobiyal patojenlere veya hastalıklara ve özellikle analizden önce dehidrasyon gerektiren numune türlerini incelerken, hücresel veya doku biyokimyasının mekansal bir ölçüsünün istendiği numune tiplerine geniş ölçüde uygulanabilir. Bakteri kültürü makrokolonilerini hazırladıktan sonra, ICO kaplı mikroskop slaytlarına monte edilen agaroz bakteri kolonilerini ambalaj malzemesinden çıkarın.
Numuneleri oda sıcaklığında 48 ila 72 saat boyunca kurutuculu kuru bir kutuya koyun. Kolonileri agar yüzeyindeki deformasyonlar açısından görsel olarak inceleyin. Ardından, vakum hattını numune odasına kapatın ve vakum pompasının ısınmasına ve uygun vakum basıncına ulaşmasına izin vermek için güç anahtarını döner kanatlı pompaya açın.
Odanın etrafına sarılmış tel filamentini ısıtmak için değişken voltajlı transformatörü açın. Vakum odasının iç sıcaklığı yaklaşık 50 santigrat dereceye ulaşana kadar değişken güç kaynağını ayarlayın. Pompa ısınırken, soğuk tuzak kondenserine bir bulamaç kuru buz ve% 100 etanol yerleştirin.
16 milimetrelik çift bez flanş kelepçelerini gevşetmek için bir anahtar kullanarak vakum odasını açın. Agaroz örneklerini odaya yerleştirin ve odayı 16 milimetrelik çift bez flanş kelepçeleriyle sıkıca kapatın. Ardından, odayı boşaltmak için pompa valfini açın ve numunelerin 60 ila 120 dakika kurumasını bekleyin.
Tamamlandığında, döner kanatlı pompadaki valfi kapatarak ve vakum flanşını ortam havasına açarak vakum odasını yavaşça ortam basıncına boşaltın. Odayı daha önce gösterildiği gibi açın ve kurutulmuş agaroz örneğini odadan çıkarın. Amino asitlerin ve negatif iyon modunun uygun desorpsiyonu ve iyonizasyonu için 1, 5-Diaminonaftalin MALDI matrisi kullanın.
Numuneyi püskürtücü tepsisine takın ve hazırlanan çözeltileri püskürtücü hattına yükleyin. Bilgisayar yazılımını kullanarak, matris bileşiğinin düzgün bir kaplaması için gerekli parametreleri belirtin. Bitene kadar püskürtme sırasını izleyin.
Numuneyi püskürtücü tepsisinden çıkarın ve analize kadar bir kurutma kabininde saklayın. Matris kaplı numuneyi MALDI hedef plakalı mikroskop slayt adaptörüne yerleştirin. Kalıcı belirteçler kullanarak numune alanını kapsayan en az üç referans belirteci yazın.
Güvenilir belirteçler de dahil olmak üzere mikroskop slaytının optik görüntüsünü elde etmek için düz yataklı bir tarayıcı kullanın. Şimdi makalede açıklandığı gibi bir kütle spektrometresi alet yöntemi tanımlayın. Negatif iyon modunda, 100 dalton kütle penceresini kütleden 100 ila 200 yüke göre seçin, gaz fazı sinyal zenginleştirmesi için, seçilen iyonların sürekli birikmesi yaklaşımını kullanarak, ilgili metabolitlerin kütle değerlerine göre kütleyi kapsar.
Cihazın görüntü alma yazılımını açın ve dosya adını ve konumunu, MS alma modunu, örneklenecek ilgi alanlarını ve görüntünün uzamsal çözünürlüğünü tanımlamak için kurulum sihirbazını kullanın. Cihaz numune taşıyıcısıyla senkronize etmek için optik görüntüdeki referans işaretleyicilerini kullanarak numuneyi öğretin. Ardından, yazılımın ilgi alanları seçim aracını kullanarak optik görüntüdeki ilgi alanlarını tanımlayın.
Tüm parametreler tanımlandıktan sonra, tanımlanan ilgi bölgesindeki her pikselde seri olarak bir kütle spektrumu elde etmek için edinme dizisini başlatın. Görüntü alımını takiben, verileri kütle spektrometresi platformlarını görüntülemek için satıcıya özgü bir dosya formatı olan MIS dosya uzantısıyla kaydedin. Veri dosyasını flexImaging veya SCiLS yazılım paketlerinde açın veya mzML gibi tescilli olmayan bir veri biçimine dışa aktarın ve satıcıdan bağımsız yazılımı kullanarak görselleştirin.
Referans yazılımı kullanarak, örneklenen bölgeler arasındaki iyon dağılımlarının yanlış renkli ısı haritalarını oluşturmak için ilgilenilen zirveler için kütle pencereleri tanımlayın. Ortalama kütle spektrumu ekranında, ilgilenilen zirveye yakınlaştırın ve tepe profilinin alanını kapsayan uygun bir kütle penceresi seçin. Şimdi, vurgulanan kütle penceresine sağ tıklayın ve Kütle Filtresi Ekle'yi seçin.
Yüksek çözünürlüklü doğru kütle ölçümü ile belirlenen şüpheli metabolitin geçici tanımlamasını kullanarak seçilen kütleyi yük değerine göre etiketleyin. Yanlış renkli ısı haritası tarafından görüntülenen analit görüntüsünün dinamik aralığını ayarlamak için yoğunluk eşiğini seçin. Kütle filtreleme parametrelerini, kütle penceresi tepe profilinin alanını kapsayacak şekilde ayarlayın ve ardından kütle filtresini ekleyin.
Tüm kriyoseksiyon ekipmanlarını% 100 etanol ile durulayarak temizleyin ve numuneleri kriyostat odasına yerleştirmeden önce kurumaya bırakın. İletken kaplama ile slaytın kenarını tanımlamak için bir ohmmetre kullanarak İTO kaplı mikroskop slaytları hazırlayın. Elmas uçlu bir yazıcı kullanarak, mikroskop slaytının İTO kaplı tarafını kazıyın ve etiketleyin.
Daha sonra bir araştırma kriyomikrotomunda kriyoseksiyon yapın. OCT'ye gömülü fare çeka dokularını 80 santigrat derece dondurucudan kuru buz üzerindeki kriyomikrotom odasına aktarın. Kriyomikrotom odasının içinde, OCT gömülü dokuyu ek bir OCT çözeltisi kullanarak bir numune mandren üzerine monte edin.
OCT çözeltisi katılaştıktan sonra, mandren numune kafasına sabitleyin ve organın istenen doku derinliğine veya düzlemine ulaşmak için 10 ila 50 mikrometrelik artışlarla kriyoseksiyona başlayın. Dokunun optimal bir kesitine ulaşıldıktan sonra, 12 mikrometre kalınlığında kesitler toplamaya başlayın. Sanatçı boya fırçalarını kullanarak dilimi yavaşça manipüle edin ve Teflon kaplı mikroskop slaydına yerleştirin.
Teflon kaplı slayttan doku almak için, ICO kaplı mikroskop slaytını doku bölümünün üzerine yuvarlayın. Avuç içini ICO kaplı slaytın arkasına bastırarak doku bölümünü mikroskop slaytına dikin. Doku bölümü yarı saydamdan opak veya mat bir dokuya geçene kadar çözülmeye devam edin.
Aynı gün analizi için, dokuya monte mikroskop slaytlarını kuru buz üzerinde depolama için dezikantlı kuru bir kutuya aktarın. Daha önce gösterildiği gibi MALDI matris uygulamasını ve MALDI görüntüleme kütle spektrometresini gerçekleştirin. Birden fazla biyolojik replikasyondan iyon görüntülerini analiz edin ve SCiLS istatistik yazılımını kullanarak yoğunluk kutusu grafiği karşılaştırmaları yoluyla sonuçları bir anlamlılık için karşılaştırın.
Bakteri kültürü örneklerinin negatif iyon modu MALDI analizi, düzinelerce metabolitin tespit edilmesini sağlar. Yüksek çözünürlüklü doğru kütle ölçümleri, ornitin ve arginin'in geçici olarak tanımlanmasına izin verir. Görüntüleme kütle spektrometresi analizi için ölçüm bölgeleri gösterilmiştir.
Bu örneklerin görüntüleme kütle spektrometrisi, Enterococcus faecalis varlığında değişmiş ve farklı şekilde lokalize edilmiş bulunan hem ornitin hem de arginin amino asit metabolitlerinin mekansal haritalandırılmasına izin verir. Enfekte fare cecasının doku morfolojisi hematoksilin ve eozin boyama kullanılarak görselleştirildi. Fare ceca dokularının optik görüntüleri 1, 5-Diaminonaftalin MALDI matriks tabakası uygulandıktan sonra gösterilmiştir.
Ornitin ve arginin için MALDI iyon görüntüleri, doku örnekleri boyunca benzersiz uzamsal dağılımlar gösterir. Bu protokol için en önemli husus, numunenin köpürmesini, çatlamasını ve diğer deformasyonunu en aza indirmek için bakteri kültürü örneklerinin nazik bir şekilde kurutulmasını ve işlenmesini sağlamaktır. Görüntüleme kütle spektrometrisini takiben, doku morfolojisini değerlendirmek için doku örneklerinin parlak alan ve floresan mikroskopi analizleri yapılabilir.
Bu aynı zamanda antikor tabanlı görüntüleme yöntemlerini kullanarak moleküler yolakların hedefli olarak doğrulanmasını da sağlayabilir.
