Наш протокол позволяет визуализировать пространственный метаболизм микробных взаимодействий, происходящих во время инфекции. Мы разработали этот рабочий процесс масс-спектрометрии для бактериальных кокультур, выращенных на агаровых и тканевых моделях. Анализ нетрадиционных субстратов, таких как бактериальные культуры, выращенные на агаре, сопряжен со многими проблемами.
Используя наш протокол, бактериальные образцы могут быть соответствующим образом высушены, чтобы облегчить применение матрицы MALDI при последующем масс-спектрометрическом анализе изображений. Этот метод широко применим к различным метаболитам, микробным патогенам или заболеваниям, а также к типам образцов, где требуется пространственная мера клеточной или тканевой биохимии, особенно при изучении типов образцов, которые требуют обезвоживания перед анализом. После подготовки макроколоний бактериальных культур удалите колонии агарозных бактерий, установленные на предметных стеклах микроскопа с покрытием ITO, из упаковочного материала.
Поместите образцы в сухую коробку с влагопоглотителем на 48-72 часа при комнатной температуре. Визуально осмотрите колонии на предмет деформаций на поверхности агара. Затем закройте вакуумную линию с камерой для отбора проб и включите выключатель питания пластинчато-роторного насоса, чтобы вакуумный насос нагрелся и достиг надлежащего вакуумного давления.
Включите трансформатор переменного напряжения, чтобы нагреть нить накаливания, обернутую вокруг камеры. Отрегулируйте переменный источник питания до тех пор, пока внутренняя температура вакуумной камеры не достигнет примерно 50 градусов по Цельсию. Пока насос нагревается, поместите суспензию сухого льда и 100% этанола в конденсатор холодной ловушки.
Откройте вакуумную камеру с помощью гаечного ключа, чтобы ослабить 16-миллиметровые двойные тканевые фланцевые зажимы. Вставьте образцы агарозы в камеру и плотно закройте камеру 16-миллиметровыми двойными тканевыми фланцевыми зажимами. Затем откройте клапан насоса для вакуумирования камеры и дайте образцам высохнуть в течение 60–120 минут.
По завершении медленно выпустите вакуумную камеру под давлением окружающей среды, закрыв клапан пластинчато-роторного насоса и открыв вакуумный фланец для окружающего воздуха. Откройте камеру, как показано ранее, и извлеките высушенный образец агарозы из камеры. Используйте матрицу 1, 5-Diaminonaphthalene MALDI для ее благоприятной десорбции и ионизации аминокислот и режима отрицательных ионов.
Приложите образец к поддону опрыскивателя и загрузите приготовленные растворы в линию опрыскивателя. С помощью компьютерного программного обеспечения укажите необходимые параметры для равномерного покрытия матричного соединения. Следите за последовательностью опрыскивания, пока оно не будет завершено.
Извлеките образец из поддона опрыскивателя и храните его в сушильном шкафу до анализа. Вставьте образец с матричным покрытием в адаптер предметного стекла микроскопа с целевой пластиной MALDI. Нанесите не менее трех фидуциальных маркеров, которые охватывают область образца с помощью перманентных маркеров.
Используйте планшетный сканер для получения оптического изображения предметного стекла микроскопа, включая фидуциарные маркеры. Теперь определим метод масс-спектрометрического прибора, как описано в рукописи. В режиме отрицательных ионов выберите окно массы 100 дальтон от массы по заряду от 100 до 200 для обогащения сигнала газовой фазы с использованием подхода непрерывного накопления выбранных ионов, который охватывает значения массы по заряду интересующих метаболитов.
Откройте программное обеспечение прибора для получения изображений и используйте мастер настройки, чтобы определить имя и местоположение файла, режим сбора MS, области интереса для выборки и пространственное разрешение изображения. Обучите образец, используя фидуциальные маркеры из оптического изображения для синхронизации с носителем образца прибора. Затем определите области интереса на оптическом изображении с помощью инструмента выбора областей интереса программного обеспечения.
После того, как все параметры определены, запустите последовательность сбора данных, чтобы последовательно получить масс-спектр на каждом пикселе в определенной области интереса. После получения изображения сохраните данные с расширением файла MIS, которое является форматом файла для конкретных поставщиков для платформ масс-спектрометрии изображений. Откройте файл данных в пакетах программного обеспечения flexImaging или SCiLS или экспортируйте его в непатентованный формат данных, такой как mzML, и визуализируйте с помощью программного обеспечения, не зависящего от поставщика.
Используя эталонное программное обеспечение, определите окна масс для интересующих пиков, чтобы создать тепловые карты ложных цветов распределения ионов в отобранных областях. На дисплее среднего масс-спектра увеличьте масштаб до интересующего пика и выберите соответствующее окно массы, охватывающее область профиля пика. Теперь щелкните правой кнопкой мыши выделенное окно массы и выберите «Добавить массовый фильтр».
Пометьте выбранную массу значением заряда, используя предварительную идентификацию предполагаемого метаболита, как это определено точным измерением массы с высоким разрешением. Выберите порог интенсивности, чтобы настроить динамический диапазон изображения анализируемого вещества, отображаемого тепловой картой ложных цветов. Далее отрегулируйте параметры фильтрации массы таким образом, чтобы окно массы охватывало область профиля пика, а затем добавьте фильтр массы.
Очистите все криосекционное оборудование, промыв его 100% этанолом, и дайте высохнуть перед помещением образцов в криостатную камеру. Подготовьте предметные стекла микроскопа с покрытием ITO с помощью омметра, чтобы определить сторону предметного стекла с проводящим покрытием. С помощью писца с алмазным наконечником протравите и пометьте сторону предметного стекла микроскопа с покрытием ITO.
Затем выполняют криоссекцию на исследовательском криомикротоме. Перенесите ткани слепой кишки мыши со встроенным ОКТ из морозильной камеры при температуре 80 градусов Цельсия в камеру криомикротома на сухом льду. Внутри камеры криомикротома установите ткань, встроенную в ОКТ, на патрон для образца с помощью дополнительного раствора ОКТ.
После того, как раствор ОКТ затвердеет, прикрепите патрон к головке образца и начните криосекцию с шагом от 10 до 50 микрометров, чтобы достичь желаемой глубины ткани или плоскости органа. Как только будет достигнуто оптимальное поперечное сечение ткани, начните собирать срезы толщиной 12 микрометров. Аккуратно обработайте срез с помощью кистей художника и поместите его на предметное стекло микроскопа с тефлоновым покрытием.
Чтобы собрать ткань с предметного стекла с тефлоновым покрытием, нанесите предметное стекло микроскопа с покрытием ITO поверх участка ткани. Отморозьте срез ткани на предметном стекле микроскопа, прижав ладонь к задней части предметного стекла с покрытием ITO. Продолжайте размораживать до тех пор, пока участок ткани не перейдет из полупрозрачного в непрозрачный или матовый.
Для анализа в тот же день перенесите предметные стекла микроскопа, установленные на ткани, на сухом льду в сухой ящик с влагопоглотителем для хранения. Выполните матричное приложение MALDI и масс-спектрометрию изображений MALDI, как показано ранее. Проанализируйте ионные изображения из нескольких биологических реплик и сравните результаты на предмет значимости с помощью сравнения диаграмм интенсивности с использованием статистического программного обеспечения SCiLS.
Отрицательно-ионный MALDI-анализ образцов бактериальных культур позволяет обнаружить десятки метаболитов. Точные измерения массы с высоким разрешением позволяют предварительно идентифицировать орнитин и аргинин. Показаны области измерения для визуализационного масс-спектрометрического анализа.
Масс-спектрометрия изображений этих образцов позволяет пространственно картировать метаболиты аминокислот орнитина и аргинина, которые, как было обнаружено, изменены и дифференцированно локализованы в присутствии Enterococcus faecalis. Морфологию тканей инфицированных мышей ceca визуализировали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином. Показаны оптические изображения тканей слепой кишки мыши после нанесения матричного слоя 1,5-диаминонафталина MALDI.
Ионные изображения орнитина и аргинина MALDI демонстрируют уникальное пространственное распределение по образцам тканей. Наиболее важным соображением для этого протокола является поддержание бережной сушки и обращения с образцами бактериальных культур, чтобы свести к минимуму пузыри, растрескивание и другую деформацию образца. После масс-спектрометрии визуализации можно провести анализ образцов тканей с помощью светлопольной и флуоресцентной микроскопии для оценки морфологии ткани.
Это также может обеспечить целенаправленную валидацию молекулярных путей с использованием методов визуализации на основе антител.
