يتيح بروتوكولنا تصور التمثيل الغذائي المكاني للتفاعلات الميكروبية التي تحدث أثناء العدوى. لقد قمنا بتطوير سير عمل قياس الطيف الكتلي التصويري هذا للمزارع البكتيرية المشتركة المزروعة على نماذج الآجار والأنسجة. يمثل تحليل الركائز غير التقليدية مثل الثقافات البكتيرية المزروعة على أجار العديد من التحديات.
باستخدام بروتوكولنا ، يمكن تجفيف العينات البكتيرية بشكل مناسب لتسهيل تطبيق مصفوفة MALDI في تحليل مطياف الكتلة التصويري اللاحق. تنطبق هذه الطريقة على نطاق واسع على مجموعة متنوعة من المستقلبات أو مسببات الأمراض الميكروبية أو الأمراض وأنواع العينات حيث يكون القياس المكاني للكيمياء الحيوية الخلوية أو النسيجية مطلوبا ، خاصة عند دراسة أنواع العينات التي تتطلب الجفاف قبل التحليل. بعد تحضير المستعمرات الكبيرة للثقافة البكتيرية ، قم بإزالة مستعمرات الأغاروز البكتيرية المثبتة على شرائح مجهر مغلفة ب ITO من مواد التعبئة والتغليف.
ضع العينات في صندوق جاف مع مجفف لمدة 48 إلى 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة. فحص بصريا المستعمرات بحثا عن تشوهات في سطح أجار. بعد ذلك ، أغلق خط الفراغ إلى غرفة العينة ، وقم بتشغيل مفتاح الطاقة إلى مضخة الريشة الدوارة للسماح لمضخة التفريغ بالتسخين وتحقيق ضغط فراغ مناسب.
قم بتشغيل محول الجهد المتغير لتسخين خيوط الأسلاك الملفوفة حول الغرفة. اضبط مصدر الطاقة المتغير حتى تصل درجة الحرارة الداخلية لغرفة التفريغ إلى حوالي 50 درجة مئوية. أثناء تسخين المضخة ، ضع ملاطا من الثلج الجاف والإيثانول بنسبة 100٪ في مكثف المصيدة الباردة.
افتح حجرة التفريغ باستخدام مفتاح ربط لفك مشابك شفة القماش المزدوجة مقاس 16 ملم. أدخل عينات الأغاروز في الحجرة ، وأغلق الحجرة بإحكام باستخدام مشابك شفة القماش المزدوجة مقاس 16 ملم. ثم افتح صمام المضخة لإخلاء الغرفة ، واترك العينات تجف لمدة 60 إلى 120 دقيقة.
عند الانتهاء ، قم بتهوية غرفة التفريغ ببطء إلى الضغط المحيط عن طريق إغلاق الصمام الموجود على مضخة الريشة الدوارة ، وفتح شفة التفريغ للهواء المحيط. افتح الحجرة كما هو موضح سابقا ، وقم بإزالة عينة الأغاروز المجففة من الحجرة. استخدم مصفوفة 1،5-ديامينونفثالين MALDI لامتزازها وتأين الأحماض الأمينية ووضع الأيونات السالبة.
قم بتوصيل العينة بصينية الرش ، وقم بتحميل الحلول المعدة في خط البخاخ. باستخدام برنامج الكمبيوتر ، حدد المعلمات اللازمة لطلاء موحد لمركب المصفوفة. راقب تسلسل الرش حتى الانتهاء.
أخرج العينة من صينية الرش ، وقم بتخزينها في خزانة تجفيف حتى التحليل. أدخل العينة المغلفة بالمصفوفة في محول شرائح مجهر اللوحة المستهدفة MALDI. قم بتسجيل ما لا يقل عن ثلاث علامات إيمانية تشمل منطقة العينة باستخدام علامات دائمة.
استخدم ماسحا ضوئيا مسطحا للحصول على صورة بصرية لشريحة المجهر بما في ذلك العلامات الائتمانية. الآن حدد طريقة أداة قياس الطيف الكتلي كما هو موضح في المخطوطة. في وضع الأيونات السالبة ، حدد نافذة كتلة 100 دالتون من الكتلة بالشحنة 100 إلى 200 لإثراء إشارة الطور الغازي باستخدام نهج التراكم المستمر للأيونات المختارة التي تشمل قيم الكتلة حسب الشحنة للمستقلبات ذات الأهمية.
افتح برنامج الحصول على الصور الخاص بالأداة ، واستخدم معالج الإعداد لتحديد اسم الملف وموقعه ، ووضع اكتساب MS ، ومناطق الاهتمام التي سيتم أخذ عينات منها ، والدقة المكانية للصورة. قم بتدريس العينة باستخدام العلامات الائتمانية من الصورة البصرية للمزامنة مع حامل عينة الجهاز. ثم حدد مناطق الاهتمام على الصورة البصرية باستخدام أداة اختيار مناطق الاهتمام الخاصة بالبرنامج.
بمجرد تحديد جميع المعلمات ، ابدأ تسلسل الاستحواذ للحصول على طيف كتلي بشكل متسلسل عند كل بكسل عبر منطقة الاهتمام المحددة. بعد الحصول على الصورة ، احفظ البيانات بامتداد ملف MIS وهو تنسيق ملف خاص بالبائع لمنصات قياس الطيف الكتلي للتصوير. افتح ملف البيانات في flexImaging، أو حزم برامج SCiLS، أو قم بالتصدير إلى تنسيق بيانات غير مملوك مثل mzML، وتصور باستخدام برنامج محايد للمورد.
باستخدام البرنامج المرجعي ، حدد النوافذ الجماعية للقمم ذات الأهمية لإنشاء خرائط حرارية ملونة خاطئة لتوزيعات الأيونات عبر المناطق التي تم أخذ عينات منها. في متوسط عرض الطيف الكتلي ، قم بتكبير ذروة الاهتمام ، وحدد نافذة كتلة مناسبة تشمل منطقة ملف تعريف الذروة. الآن ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق نافذة الكتلة المميزة ، وحدد إضافة مرشح جماعي.
قم بتسمية الكتلة المحددة بقيمة الشحنة باستخدام التحديد المبدئي للمستقلب المشتبه به كما هو محدد بواسطة قياس الكتلة الدقيق عالي الدقة. حدد عتبة الكثافة لضبط النطاق الديناميكي للصورة المراد تحليلها المعروضة بواسطة خريطة الحرارة الملونة الزائفة. قم بضبط معلمات تصفية الكتلة بشكل أكبر بحيث تشمل نافذة الكتلة منطقة ملف تعريف الذروة ، ثم أضف مرشح الكتلة.
نظف جميع معدات الاستئصال بالتبريد عن طريق شطفها بالإيثانول بنسبة 100٪ ، واتركها تجف قبل وضع العينات في غرفة التبريد. قم بإعداد شرائح المجهر المطلية ب ITO باستخدام مقياس الأومتر لتحديد جانب الشريحة بالطلاء الموصل. باستخدام ناسخ ذو رأس ماسي ، قم بحفر وتسمية الجانب المطلي ب ITO من شريحة المجهر.
ثم قم بإجراء التشريح بالتبريد على الميكروتوم البردي البحثي. انقل أنسجة CECA للفأر المضمنة في OCT من مجمد 80 درجة مئوية إلى غرفة cryomicrotome على الثلج الجاف. داخل غرفة الميكروتوم البردي ، قم بتركيب الأنسجة المضمنة في OCT على ظرف عينة باستخدام محلول OCT إضافي.
بعد أن يتجمد محلول OCT ، ثبت الظرف على رأس العينة وابدأ في الاستئصال بالتبريد بزيادات من 10 إلى 50 ميكرومتر للوصول إلى عمق الأنسجة المطلوب أو مستوى العضو. بمجرد الوصول إلى المقطع العرضي الأمثل للأنسجة ، ابدأ في جمع المقاطع بسمك 12 ميكرومتر. تعامل مع الشريحة برفق باستخدام فرش الرسم الفنية ، وضعها على شريحة مجهر مطلية بالتفلون.
لالتقاط الأنسجة من الشريحة المطلية بالتفلون ، قم بلف شريحة المجهر المطلي ب ITO أعلى قسم الأنسجة. قم بإذابة جزء الأنسجة على شريحة المجهر عن طريق الضغط على راحة اليد في الجزء الخلفي من الشريحة المطلية ب ITO. استمر في الذوبان حتى ينتقل قسم الأنسجة من نسيج شفاف إلى قوام معتم أو غير لامع.
للتحليل في نفس اليوم ، انقل شرائح المجهر المثبتة على الأنسجة على الثلج الجاف إلى صندوق جاف به مجفف للتخزين. إجراء تطبيق مصفوفة MALDI وقياس الطيف الكتلي التصويري MALDI كما هو موضح سابقا. تحليل الصور الأيونية من مكررات بيولوجية متعددة ، ومقارنة النتائج للحصول على أهمية عبر مقارنات مخطط مربع الكثافة باستخدام برنامج SCiLS الإحصائي.
وضع الأيونات السالبة يسمح تحليل MALDI لعينات الثقافة البكتيرية بالكشف عن العشرات من الأيضات. تسمح قياسات الكتلة الدقيقة عالية الدقة بالتحديد المبدئي للأورنيثين والأرجينين. يتم عرض مناطق القياس لتحليل قياس الطيف الكتلي للتصوير.
يسمح قياس الطيف الكتلي التصويري لهذه العينات برسم الخرائط المكانية لكل من مستقلبات الأحماض الأمينية ornithine و arginine التي وجد أنها متغيرة وموضعية بشكل تفاضلي في وجود المكورات المعوية البرازية. تم تصور مورفولوجيا الأنسجة من الفئران المصابة ceca باستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين. يتم عرض الصور البصرية لأنسجة الفأر ceca بعد تطبيق طبقة مصفوفة 1،5-Diaminonaphthalene MALDI.
تعرض صور أيون MALDI للأورنيثين والأرجينين توزيعات مكانية فريدة عبر عينات الأنسجة. أهم اعتبار لهذا البروتوكول هو الحفاظ على التجفيف اللطيف والتعامل مع عينات الثقافة البكتيرية لتقليل الفقاعات والتشقق والتشوهات الأخرى للعينة. بعد قياس الطيف الكتلي التصويري ، يمكن إجراء تحليلات مجهرية ساطعة ومضان لعينات الأنسجة لتقييم مورفولوجيا الأنسجة.
يمكن أن يتيح ذلك أيضا التحقق المستهدف من المسارات الجزيئية باستخدام طرق التصوير القائمة على الأجسام المضادة.
