우리의 프로토콜은 감염 중에 발생하는 미생물 상호 작용의 공간적 대사를 시각화할 수 있습니다. 우리는 한천 및 조직 모델에서 성장한 박테리아 공동 배양을 위한 이 이미징 질량 분석 워크플로우를 개발했습니다. 한천에서 자란 박테리아 배양과 같은 비전통적인 기질을 분석하는 것은 많은 과제를 제시합니다.
당사의 프로토콜을 사용하여 박테리아 표본을 적절하게 건조하여 후속 이미징 질량 분석 분석에서 MALDI 매트릭스 적용을 용이하게 할 수 있습니다. 이 방법은 다양한 대사 산물, 미생물 병원체 또는 질병, 세포 또는 조직 생화학의 공간적 측정이 필요한 시료 유형, 특히 분석 전에 탈수가 필요한 시료 유형을 연구할 때 광범위하게 적용할 수 있습니다. 박테리아 배양 거대콜로니를 준비한 후, ITO 코팅된 현미경 슬라이드에 장착된 아가로스 박테리아 콜로니를 포장재로부터 제거한다.
샘플을 실온에서 48 내지 72시간 동안 건조제가 있는 드라이 박스에 넣는다. 한천 표면의 변형에 대해 콜로니를 육안으로 검사하십시오. 그런 다음 샘플 챔버의 진공 라인을 닫고 로터리 베인 펌프의 전원 스위치를 켜서 진공 펌프가 예열되고 적절한 진공 압력에 도달할 수 있도록 합니다.
가변 전압 변압기를 켜서 챔버를 감싸고 있는 와이어 필라멘트를 가열합니다. 진공 챔버의 내부 온도가 약 섭씨 50도에 도달할 때까지 가변 전원 공급 장치를 조정합니다. 펌프가 예열되는 동안 드라이 아이스와 100% 에탄올 슬러리를 콜드 트랩 콘덴서에 넣습니다.
렌치를 사용하여 진공 챔버를 열어 16mm 이중 천 플랜지 클램프를 풉니다. 아가로스 샘플을 챔버에 삽입하고 16mm 이중 천 플랜지 클램프로 챔버를 단단히 밀봉합니다. 그런 다음 펌프 밸브를 열어 챔버를 비우고 샘플을 60-120분 동안 건조시킵니다.
완료되면 로터리 베인 펌프의 밸브를 닫고 진공 플랜지를 주변 공기로 열어 진공 챔버를 주변 압력으로 천천히 배출합니다. 이전에 입증된 바와 같이 챔버를 열고, 건조된 아가로스 샘플을 챔버로부터 제거한다. 1, 5-Diaminonaphthalene MALDI 매트릭스를 사용하여 아미노산 및 음이온 모드의 유리한 탈착 및 이온화를 수행합니다.
샘플을 분무기 트레이에 부착하고 준비된 용액을 분무기 라인에 로드합니다. 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 매트릭스 화합물의 균일 한 코팅에 필요한 매개 변수를 지정하십시오. 완료될 때까지 분무 순서를 모니터링합니다.
분무기 트레이에서 샘플을 제거하고 분석할 때까지 건조 캐비닛에 보관합니다. 매트릭스 코팅된 샘플을 MALDI 타겟 플레이트 현미경 슬라이드 어댑터에 삽입합니다. 영구 마커를 사용하여 샘플 영역을 둘러싸는 최소 3개의 기준 마커를 새깁니다.
평판 스캐너를 사용하여 신탁 마커를 포함한 현미경 슬라이드의 광학 이미지를 획득합니다. 이제 원고에 설명된 대로 질량 분석 기기 방법을 정의합니다. 음이온 모드에서, 관심 있는 대사산물의 전하 값에 의한 질량을 포함하는 선택된 이온의 연속 축적 접근법을 사용하여 기체상 신호 농축을 위해 전하 질량 100에서 200까지 100 달톤 질량 창을 선택합니다.
계측기의 이미지 수집 소프트웨어를 열고 설정 마법사를 사용하여 파일 이름과 위치, MS 획득 모드, 샘플링할 관심 영역 및 이미지의 공간 해상도를 정의합니다. 광학 이미지의 기준 마커를 사용하여 기기 샘플 캐리어와 동기화하여 샘플을 가르칩니다. 그런 다음 소프트웨어의 관심 영역 선택 도구를 사용하여 광학 이미지에서 관심 영역을 정의합니다.
모든 파라미터가 정의되면, 수집 시퀀스를 시작하여 정의된 관심 영역의 각 픽셀에서 질량 스펙트럼을 연속적으로 수집합니다. 이미지 획득 후 이미징 질량 분석 플랫폼을 위한 공급업체별 파일 형식인 MIS 파일 확장자로 데이터를 저장합니다. flexAging 또는 SCiLS 소프트웨어 패키지에서 데이터 파일을 열거나 mzML과 같은 비독점 데이터 형식으로 내보내고 공급업체 중립적인 소프트웨어를 사용하여 시각화합니다.
참조 소프트웨어를 사용하여 관심 피크에 대한 질량 창을 정의하여 샘플링된 영역 전체에 걸쳐 이온 분포의 잘못된 색상 히트 맵을 생성합니다. 평균 질량 스펙트럼 디스플레이에서 관심 있는 피크를 확대하고 피크 프로파일 영역을 포함하는 적절한 질량 창을 선택합니다. 이제 강조 표시된 매스 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 매스 필터 추가(Add Mass Filter)를 선택합니다.
고분해능 정확한 질량 측정에 의해 결정된 의심되는 대사 산물의 잠정적 식별을 사용하여 전하 값으로 선택된 질량을 표시합니다. 강도 임계값을 선택하여 false color heat map에 의해 표시되는 분석물 이미지의 동적 범위를 조정합니다. 질량 필터링 파라미터를 추가로 조정하여 질량 창이 피크 프로파일의 영역을 포함하도록 한 다음 질량 필터를 추가합니다.
모든 냉동 절개 장비를 100% 에탄올로 헹구어 세척하고 샘플을 저온 유지 장치 챔버에 넣기 전에 건조시키십시오. 전도성 코팅이 된 슬라이드의 측면을 식별하기 위해 저항계를 사용하여 ITO 코팅된 현미경 슬라이드를 준비합니다. 다이아몬드 팁이 있는 스크라이브를 사용하여 현미경 슬라이드의 ITO 코팅된 면을 에칭하고 라벨링합니다.
그런 다음 연구용 cryomicrotome에서 cryosectioning을 수행합니다. OCT 내장 마우스 ceca 조직을 섭씨 80도 냉동고에서 드라이아이스의 극저온 마이크로톰 챔버로 옮깁니다. cryomicrotome 챔버 내에서 추가 OCT 용액을 사용하여 OCT 내장 조직을 샘플 척에 장착합니다.
OCT 용액이 응고된 후 척을 표본 헤드에 고정하고 10-50마이크로미터 단위로 냉동 절편을 시작하여 장기의 원하는 조직 깊이 또는 평면에 도달합니다. 조직의 최적 단면에 도달하면 12마이크로미터 두께로 절편을 수집하기 시작합니다. 아티스트 페인트 브러시를 사용하여 슬라이스를 부드럽게 조작하고 테프론 코팅된 현미경 슬라이드에 놓습니다.
테프론 코팅 슬라이드에서 조직을 채취하려면 ITO 코팅 현미경 슬라이드를 조직 섹션 위에 굴립니다. 손바닥을 ITO 코팅 슬라이드의 뒤쪽으로 눌러 조직 부분을 현미경 슬라이드에 해동합니다. 조직 섹션이 반투명에서 불투명하거나 무광택 질감으로 전환될 때까지 해동 장착을 계속합니다.
당일 분석을 위해 드라이아이스에 조직 장착형 현미경 슬라이드를 건조제가 있는 드라이 박스로 옮겨 보관합니다. 앞서 설명한 대로 MALDI 매트릭스 애플리케이션과 MALDI 이미징 질량분석법을 수행합니다. 여러 생물학적 복제물에서 이온 이미지를 분석하고 SCiLS 통계 소프트웨어를 사용하여 강도 상자 그림 비교를 통해 유의성에 대한 결과를 비교합니다.
박테리아 배양 샘플의 음이온 모드 MALDI 분석을 통해 수십 개의 대사 산물을 검출할 수 있습니다. 고분해능의 정확한 질량 측정을 통해 오르니틴과 아르기닌을 잠정적으로 식별할 수 있습니다. 이미징 질량 분석 분석을 위한 측정 영역이 표시됩니다.
이러한 샘플의 이미징 질량 분석법은 Enterococcus faecalis의 존재 하에서 변경되고 차별적으로 국한되는 것으로 밝혀진 오르니틴 및 아르기닌 아미노산 대사 산물의 공간 매핑을 허용합니다. 감염된 마우스 ceca의 조직 형태는 헤마톡실린 및 에오신 염색을 사용하여 시각화되었습니다. 1,5-디아미노나프탈렌 MALDI 매트릭스 층을 적용한 후의 마우스 세카 조직의 광학 이미지를 나타내었다.
오르니틴 및 아르기닌에 대한 MALDI 이온 이미지는 조직 샘플 전반에 걸쳐 고유한 공간 분포를 보여줍니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 고려 사항은 시료의 기포, 균열 및 기타 변형을 최소화하기 위해 박테리아 배양 표본의 부드러운 건조 및 취급을 유지하는 것입니다. 이미징 질량 분석법에 이어 조직 샘플의 명시야 및 형광 현미경 분석을 수행하여 조직 형태를 평가할 수 있습니다.
이것은 또한 항체 기반 이미징 방법을 사용하여 분자 경로의 표적 검증을 가능하게 할 수 있습니다.
