כאן, השתמשנו ב-FRET של מולקולה בודדת, ובתיוג חלבונים ספציפיים לאתר באמצעות שילוב טבעי של חומצות אמינו כדי לחקור את הדינמיקה הקונפורמציונית של mGluR2. זה מאפשר לחקור את הדינמיקה של החלבון מבלי להפריע למבנה החלבון. מבנה אטומי מספק תמונה סטטית של חלבון.
עם זאת, FRET של מולקולה בודדת מאפשרת לנו לדמיין את הטווח המלא של תנועת החלבון בזמן אמת ובתמיסה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי לחקור את הדינמיקה של כל חלבון. יתר על כן, שילוב טבעי של חומצות אמינו יכול לשמש לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון, והנדסה של קולטנים סינתטיים.
טעינה לדוגמה ואופטימיזציה של הדמיה דורשת סבלנות ותרגול. כדי להתחיל, סמן חורים שיש לקדוח על מגלשת הזכוכית עם טוש. השתמשו ב-Dremel כדי לקדוח חורים קטנים במגלשה בזמן שהמגלשה טבולה במים.
סוניקו את השקופיות וכסו את החלקות באצטון למשך 30 דקות במתקן לאמבטיה בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס. יש להשליך את האצטון מהמגלשה ולכסות את צנצנות ההחלקה. יש לשטוף היטב במים, ולהשתמש בהידרוקסיד אשלגן טוחן בעל חמש טוחנות למשך 30 דקות.
לאחר מכן, לשטוף את המגלשות ולכסות להחליק עם מים, ו sonicate מתנול במשך שתי דקות. השאירו את הצנצנות מלאות במתנול עד לשלב המלחת האמינו. יוצקים תערובת המלחת אמינו טרייה לתוך המגלשה ומכסים את צנצנות החלקה.
דגירה, סוניקט, ושוב דגירה של השקופיות וכיסוי החלקות בתערובת המלחת אמינו לפני השלכת התמיסה. לאחר מכן, לשטוף את הצנצנות עם מתנול לפני מילוי אותם עם מים. לאחר מכן שטפו את המגלשות במים.
יבש אותם עם אוויר נושבת, ומניחים אותם בתיבות ההרכבה. יש למרוח 60 מיליליטר של תמיסת PEGylation על המגלשה, ולהניח עליה תלוש כיסוי. סמן את הצד שאינו PEGylated לפני האחסון.
לאחר הדגירה, יש לפרק בעדינות ולשטוף את המגלשות ולכסות את החלקות במים. לאחר מכן ייבשו אותם על ידי נשיפת אוויר, והניחו אותם בצינור סטרילי של 50 מיליליטר כאשר משטח PEGylated פונה זה לזה. לאחר העברת תאי HEK 293T עם 0.05% טריפסין-EDTA, זרעו את התאים על פולי-L/D-ליזין מכסים את החלקות.
מקם את המדיה הסטנדרטית עם מדיה בתוספת AZP לגידול תאים וקולטן גלוטמט מטבוטרופי 2, או ביטוי mGluR2. לאחר מכן העבירו את התאים עם מגיב טרנספקציה, ודגרו במשך 24 שעות לפני החלפת המדיום במדיה טרייה עם תוסף AZP. 20 דקות לפני התווית עם צבעי אלקין ציאנין, שטפו את תלושי העטיפה פעמיים עם מאגר הקלטה חם, או RB, והניחו אותם במדיה סטנדרטית חמה ללא AZP.
לאחר מכן הסר את המדיה הרגילה ושטוף את התאים עם RB לפני הוספת פתרון תיוג מוכן טרי. דגירה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר הדגירה, הסר את פתרון התיוג.
שטפו את תלוש הכיסוי המכיל תאים שעברו טרנספקציה פעמיים עם ה-RB, ושעו מחדש באותו מדיום. לאחר מכן, גלולה את התאים על ידי מסתובב ב 1, 000 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולהסיר את supernatant לפני השעיה מחדש את הכדור ב 80 עד 130 microliters של תמיסת תמיסה. לשבור את הכדור על ידי פיפטה.
לאחר מכן לעטוף אותו בנייר כסף, ומניחים אותו על הנדנדה בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עד שעה אחת כדי lyse את התאים. גלולה את החלק המסיס על ידי צנטריפוגה ב 20, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן מעבירים את הסופרנטנט לצינור קר טרי, ומאחסנים אותו על קרח.
הסירו את המגלשה וכיסוי מהמקפיא, ותנו להם להתחמם בטמפרטורת החדר בחושך. הרכיבו את התא על ידי כריכה של רצועות הסרט הדו-צדדי בין המגלשה לחלקת הכיסוי, כדי להבטיח שמשטחי ה-PEGylated יהוו את פנים תא הזרימה. באמצעות קצה פיפטה, לחצו על הכיסוי כדי לוודא שהקלטת באה במגע עם הכיסוי ומחליקה.
יש למרוח אפוקסי על קצות השקופית. יש למרוח 40 מיקרוליטרים של NeutrAvidin בגודל 500 ננומולרים על כל נתיב, ולדגור בתוך קופסה כהה ולחות. לאחר שתי דקות, לשטוף כל נתיב תא עם 100 microliters של חיץ T50.
לאחר מכן הוסיפו 20 תמיסת נוגדנים ביוטינילציה ננומולרית, ודגרה במשך 30 דקות לפני השטיפה עם 200 מיקרוליטר של חיץ T50 לכל נתיב. הפעל את המחשב ואת המיקרוסקופ. לאחר מכן הפעל את הלייזרים כדי להתחמם.
לאחר מכן, הפעל את מצלמת EMCCD ופתח את התוכנה. הרכיבו את תא הדגימה על במת המיקרוסקופ, והוסיפו את דגימת החלבון בהדרגה כדי להשיג כ-400 מולקולות לכל שדה ראייה. לשטוף את החדר עם 100 microliters של מאגר הדמיה בתוספת 0.3 יחידות של protocatechuate 3, 4-dioxygenase.
התאם את הרווח, קצב הרכישה וכוחות הלייזר כדי לזהות אותות פלואורסצנטיים של מולקולה בודדת הן בערוץ התורם והן בערוצים המקבלים. לאחר מכן להלהיב את התורם, ולרכוש עקבות זמן עד 80% מהמולקולות התורמות בשדה הראייה עוברות פוטו-אקונומיקה. בסוף הסרט, הפעל את הלייזר בגודל 640 ננומטר כדי לעורר ישירות את המקבל עד שחלק מהמולקולות עוברות פוטו-אקונומיקה.
שנה את שדה הראייה, וחזור על השלבים לעירור של תורם ומקבל כדי לאסוף שלושה סרטים לכל תנאי. לבחירת עקבות FRET של מולקולה בודדת לאיסוף חלקיקים, בחר את העקבות שבהם העוצמה הכוללת של עקבות התורם והמקבל יציבה לאורך זמן. לאחר מכן בחר את העקבות עם שינויים אנטי-מתואמים בעוצמות התורם והמקבל.
בחר את מולקולות התורם והמקבל המציגות הלבנת תמונות חד-פעמיות ועקבות באורך של יותר מחמש שניות. חשב את חוסר FRET. לבסוף, זהה את המצב הקונפורמי על ידי מודלים של מרקוב מוסתר, או HMM, על ידי ביצוע השלבים המתוארים בכתב היד.
התיוג של AZP על ידי צבעי ציאנין הושג על ידי תגובת ציקלואידציה מזורזת נחושת, והביא לתיוג יעיל של קרום פלזמה של 548UAA כאשר אוכלוסיית פני השטח של התא מסומנת בפלואורופורים תורמים ומקבלים. באלקטרופורזה SDS-PAGE, נצפתה רצועה בודדת במשקל 250 קילו-דלטון בתאי HEK 293T המבטאים 548UAA, אשר חפפו ל-mGluR2 הדימרי באורך מלא. עקבות סלקטיביות מייצגות עבור מספר אירועי הלבנה קצרי מועד וארוכי טווח עבור תורמים ומקבלים מוצגים כאן.
מצבים קונפורמיים זוהו באמצעות ניתוח HMM. מעברים בין מצבי FRET בדידים הופקו מההתאמות האידיאליות, והתוו כמפת חום של צפיפות מעבר. עקבות ה- FRET האידיאליים מניבים גם מידע על זמן השהייה עבור כל אישור מזוהה.
העקבות של המולקולה הבודדת עם ערוץ התורם והמקבל מוצגים כאן. יתר על כן, מולקולה בודדת FRET חושפת ארבעה מצבים קונפורמיים של התחום העשיר בציסטאין mGluR2. שימור שיא יעיל חיוני למשיכת מולקולה בודדת כלפי מטה, ויש לנקוט בזהירות בתהליך זה.
בנוסף, יש להוסיף את חומר נטרול החמצן מיד לפני ההדמיה. שיטת תיוג זו וניסויי FRET של מולקולה בודדת יושמו על קולטנים מרובים, וסיפקו תובנות חדשות על מנגנון הפעלת הקולטן ומודולציה של תפקוד הקולטן.
