Aquí, utilizamos FRET de molécula única y etiquetado de proteínas específicas del sitio a través de una incorporación de aminoácidos naturales para estudiar la dinámica conformacional de mGluR2. Esto permite estudiar la dinámica de las proteínas sin perturbar la estructura de las proteínas. La estructura atómica proporciona una imagen estática de una proteína.
Sin embargo, FRET de molécula única nos permite visualizar el rango completo de movimiento de proteínas en tiempo real y solución. Este método se puede aplicar para estudiar la dinámica de cualquier proteína. Además, se puede utilizar una incorporación natural de aminoácidos para estudiar las interacciones proteína-proteína y la ingeniería de receptores sintéticos.
La carga de muestras y la optimización de imágenes requieren paciencia y práctica. Para comenzar, marque los agujeros que se perforarán en el portaobjetos de vidrio con un marcador. Use un Dremel para perforar pequeños agujeros en el tobogán mientras el tobogán se sumerge en agua.
Sonicar los portaobjetos y cubrir los deslizamientos en acetona durante 30 minutos en un sonicador de baño a 23 grados centígrados. Deseche la acetona de la corredera y cubra los frascos deslizantes. Enjuague bien con agua y sanice en hidróxido de potasio de cinco molares durante 30 minutos.
A continuación, enjuague los portaobjetos y cubra el deslizamiento con agua, y sanice en metanol durante dos minutos. Deje los frascos llenos de metanol hasta el paso de salinización de aminoácidos. Vierta la mezcla de salinización de aminoácidos recién preparada en los frascos de deslizamiento y cubra.
Incubar, sonicar y volver a incubar los portaobjetos y cubrir los trozos en una mezcla de salinización amino antes de desechar la solución. A continuación, lave los frascos con metanol antes de llenarlos con agua. Luego enjuague los toboganes con agua.
Séquelos con soplado de aire y colóquelos en las cajas de montaje. Aplique 60 mililitros de solución de PEGylation al portaobjetos y coloque un cubreobjetos encima. Marque el lado no PEGylated antes de almacenarlo.
Después de la incubación, desmonte suavemente y enjuague los portaobjetos y cubra los trozos con agua. Luego séquelos soplando aire y colóquelos en un tubo estéril de 50 mililitros con la superficie pegilada una de la otra. Después de pasar las células HEK 293T con 0.05% de tripsina-EDTA, siembre las células en hojas de cobertura de poli-L / D-lisina.
Coloque el medio estándar con medios suplementados con AZP para células en crecimiento y receptor metabotrópico de glutamato 2, o expresión de mGluR2. Luego transfecte las células con un reactivo de transfección e incube durante 24 horas antes de cambiar el medio con medios frescos suplementados con AZP. 20 minutos antes de etiquetar con colorantes de alquinina cianina, lave las cubiertas dos veces con Recording Buffer tibio, o RB, y colóquelas en un medio estándar tibio sin AZP.
Luego retire el medio estándar y lave las celdas con RB antes de agregar la solución de etiquetado recién preparada. Incubar durante 15 minutos a 37 grados centígrados en la oscuridad. Después de la incubación, retire la solución de etiquetado.
Lave la hoja de cubierta que contiene células transfectadas dos veces con el RB y vuelva a suspenderla en el mismo medio. A continuación, granular las células girando a 1.000 g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos, y retirar el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en 80 a 130 microlitros de la solución de lisis. Romper el pellet mediante pipeteo.
Luego envuélvalo en papel de aluminio y colóquelo en el balancín a cuatro grados centígrados durante 30 minutos a una hora para lisar las células. Granular la fracción insoluble por centrifugación a 20, 000 g y cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Luego transfiera el sobrenadante a un tubo frío fresco y guárdelo en hielo.
Retire el portaobjetos y el deslizamiento de la cubierta del congelador, y deje que se calienten a temperatura ambiente en la oscuridad. Ensamble la cámara intercalando las tiras de cinta de doble cara entre la corredera y el cubreobjetos, asegurándose de que las superficies PEGylated formen el interior de la cámara de flujo. Con la punta de una pipeta, presione el cubrebocas para asegurarse de que la cinta esté en contacto con el cubrebocado y la corredera.
Aplique epoxi en los bordes de la diapositiva. Aplique 40 microlitros de NeutrAvidin de 500 nanomolares en cada carril e incube dentro de una caja oscura humidificada. Después de dos minutos, lave cada carril de la cámara con 100 microlitros de tampón T50.
Luego agregue 20 solución de anticuerpos biotinilados nanomolares e incube durante 30 minutos antes de lavar con 200 microlitros de tampón T50 por carril. Encienda la computadora y el microscopio. Luego encienda los láseres para calentar.
A continuación, encienda la cámara EMCCD y abra el software. Monte la cámara de muestra en la etapa de microscopio y agregue la muestra de proteína gradualmente para lograr aproximadamente 400 moléculas por campo de visión. Lave la cámara con 100 microlitros de tampón de imagen complementado con 0,3 unidades de protocatecuato 3, 4-dioxigenasa.
Ajuste la ganancia, la tasa de adquisición y las potencias del láser para detectar señales de fluorescencia de una sola molécula tanto en el canal donante como en el aceptador. Luego excitar al donante, y adquirir trazas de tiempo hasta que el 80% de las moléculas donantes en el campo de visión sean fotoblanqueadas. Al final de la película, encienda el láser de 640 nanómetros para excitar directamente el aceptor hasta que algunas de las moléculas estén fotoblanqueadas.
Cambie el campo de visión y repita los pasos para la excitación del donante y el aceptante para recolectar tres películas por condición. Para seleccionar trazas FRET de una sola molécula de selección de partículas, seleccione las trazas donde la intensidad total de las trazas donante y aceptora es estable a lo largo del tiempo. A continuación, seleccione las trazas con cambios anticorrelacionados en las intensidades del donante y del aceptor.
Seleccione las moléculas donante y aceptora que muestran fotoblanqueo de un solo paso y trazas de más de cinco segundos de duración. Calcule la deficiencia de FRET. Finalmente, identifique el estado conformacional mediante el modelado oculto de Markov, o HMM, siguiendo los pasos descritos en el manuscrito.
El marcado de AZP por colorantes de cianina se logró mediante una reacción de cicloadición catalizada por cobre, y dio como resultado un marcado efectivo de la membrana plasmática de 548UAA con la población de superficie celular marcada con fluoróforos donantes y aceptores. En la electroforesis SDS-PAGE, se observó una sola banda a 250 kilodalton en células HEK 293T que expresaban 548UAA, que coincidió con el mGluR2 dimérico de longitud completa. Aquí se muestran trazas selectivas representativas para múltiples eventos de blanqueamiento de corta y larga duración para donantes y aceptantes.
Los estados conformacionales se identificaron mediante análisis de HMM. Las transiciones entre estados FRET discretos se extrajeron de los ajustes idealizados y se trazaron como un mapa de calor de densidad de transición. Las trazas FRET idealizadas también proporcionan información sobre el tiempo de permanencia para cada confirmación identificada.
Las trazas de una sola molécula con el canal donante y aceptor se muestran aquí. Además, FRET de molécula única revela cuatro estados conformacionales del dominio rico en cisteína mGluR2. La preservación eficiente del pico es esencial para la extracción de una sola molécula, y se debe tener cuidado durante este proceso.
Además, el agente eliminador de oxígeno debe agregarse inmediatamente antes de la obtención de imágenes. Este método de etiquetado y los experimentos FRET de una sola molécula se han aplicado a múltiples receptores y han proporcionado nuevos conocimientos sobre el mecanismo de activación del receptor y la modulación de la función del receptor.
