여기에서는 단일 분자 FRET와 천연 아미노산 통합을 통한 부위 특이적 단백질 표지를 사용하여 mGluR2의 구조적 역학을 연구했습니다. 이를 통해 단백질 구조를 교란하지 않고 단백질 역학을 연구 할 수 있습니다. 원자 구조는 단백질의 정적 이미지를 제공합니다.
그러나 단일 분자 FRET를 사용하면 전체 범위의 단백질 움직임을 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 이 방법은 모든 단백질의 역학을 연구하는 데 적용될 수 있습니다. 또한, 천연 아미노산 혼입은 단백질-단백질 상호 작용 및 합성 수용체의 공학을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.
샘플 로딩 및 이미징 최적화에는 인내와 연습이 필요합니다. 시작하려면 마커로 유리 슬라이드에 뚫을 구멍을 표시하십시오. Dremel을 사용하여 슬라이드를 물에 담그는 동안 슬라이드에 작은 구멍을 뚫습니다.
슬라이드를 초음파 처리하고 섭씨 23도의 목욕 초음파 처리기에서 30분 동안 아세톤으로 슬립을 덮습니다. 슬라이드에서 아세톤을 폐기하고 슬립 병을 덮으십시오. 물로 철저히 헹구고 5 몰 수산화 칼륨에서 30 분 동안 초음파 처리합니다.
다음으로, 슬라이드를 헹구고 슬립을 물로 덮고 메탄올에서 2 분 동안 초음파 처리한다. 아미노 염화 단계까지 메탄올로 채워진 항아리를 그대로 두십시오. 새로 준비한 아미노 염화 혼합물을 슬라이드에 붓고 슬립 병을 덮습니다.
인큐베이션하고, 초음파 처리하고, 용액을 버리기 전에 슬라이드를 배양하고 아미노 염화 혼합물에서 슬립을 덮는다. 다음으로, 항아리를 물로 채우기 전에 메탄올로 씻으십시오. 그런 다음 슬라이드를 물로 헹굽니다.
송풍으로 말리고 조립 상자에 넣으십시오. 슬라이드에 60ml의 PEGylation 용액을 바르고 그 위에 커버 슬립을 놓습니다. 보관하기 전에 PEG화되지 않은 면을 표시하십시오.
배양 후 부드럽게 분해하고 슬라이드를 헹구고 슬립을 물로 덮으십시오. 그런 다음 공기를 불어 건조시키고 PEG화 된 표면이 서로 마주 보도록 멸균 된 50 밀리리터 튜브에 넣습니다. HEK 293T 세포를 0.05% 트립신-EDTA로 계대배양한 후, 세포를 폴리-L/D-라이신 커버 슬립에 시드합니다.
세포 성장 및 대사성 글루타메이트 수용체 2 또는 mGluR2 발현을 위해 AZP 보충 배지와 함께 표준 배지를 놓습니다. 이어서, 세포를 형질감염 시약으로 형질감염시키고, 새로운 AZP 보충 배지로 배지를 변경하기 전에 24시간 동안 인큐베이션한다. 알킨 시아닌 염료로 라벨링하기 20분 전에 커버 슬립을 따뜻한 레코딩 버퍼(RB)로 두 번 세척하고 AZP가 없는 따뜻한 표준 배지에 넣습니다.
그런 다음 새로 준비된 라벨링 용액을 추가하기 전에 표준 배지를 제거하고 RB로 셀을 세척하십시오. 어둠 속에서 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양하십시오. 배양 후, 표지 용액을 제거한다.
형질감염된 세포를 함유하는 커버 슬립을 RB로 2회 세척하고, 동일한 배지에 재현탁시킨다. 다음에, 세포를 섭씨 4도에서 5분 동안 1, 000 g으로 방사하여 세포를 펠렛하고, 펠렛을 80 내지 130 마이크로리터의 용해 용액에 재현탁시키기 전에 상층액을 제거한다. 피펫팅으로 펠릿을 깨뜨립니다.
그런 다음 호일로 싸서 섭씨 4도의 로커에 30분에서 1시간 동안 놓아 세포를 용해시킵니다. 불용성 분획을 20, 000 g 및 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리하여 펠렛화한다. 그런 다음 상청액을 신선한 차가운 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하십시오.
냉동실에서 슬라이드와 커버 슬립을 제거하고 어두운 곳에서 실온에서 따뜻하게 합니다. 슬라이드와 커버 슬립 사이에 양면 테이프 스트립을 끼워 챔버를 조립하여 PEG화된 표면이 유동 챔버의 내부를 형성하도록 합니다. 피펫 팁을 사용하여 커버 슬립을 눌러 테이프가 커버 슬립 및 슬라이드에 접촉하는지 확인합니다.
슬라이드 가장자리에 에폭시를 바르십시오. 40 마이크로 리터의 500 나노 몰 NeutrAvidin을 각 레인에 적용하고 가습 된 다크 박스 안에서 배양하십시오. 2분 후, 각 챔버 레인을 100 마이크로리터의 T50 완충액으로 세척한다.
이어서, 20 나노몰 비오티닐화 항체 용액을 첨가하고, 레인당 200 마이크로리터의 T50 완충액으로 세척하기 전에 30분 동안 배양한다. 컴퓨터와 현미경을 켭니다. 그런 다음 레이저를 켜서 예열하십시오.
그런 다음 EMCCD 카메라를 켜고 소프트웨어를 엽니다. 샘플 챔버를 현미경 스테이지에 장착하고 단백질 샘플을 점진적으로 추가하여 시야당 약 400개의 분자를 달성합니다. 0.3 단위의 프로토 카테 추 에이트 3, 4- 디 옥시 게나 제가 보충 된 100 마이크로 리터의 이미징 버퍼로 챔버를 세척하십시오.
게인, 획득 속도 및 레이저 출력을 조정하여 공여체 및 수용체 채널 모두에서 단일 분자 형광 신호를 검출합니다. 그런 다음 기증자를 흥분시키고 시야에있는 기증자 분자의 80 %가 광 표백 될 때까지 시간 흔적을 얻습니다. 영화가 끝나면 640 나노 미터 레이저를 켜서 일부 분자가 광 표백 될 때까지 수용자를 직접 자극합니다.
시야를 변경하고 기증자와 수락자의 여기 단계를 반복하여 조건당 3개의 영화를 수집합니다. 입자 피킹의 단일 분자 FRET 트레이스를 선택하려면 공여체 및 수용체 트레이스의 총 강도가 시간이 지남에 따라 안정적인 트레이스를 선택하십시오. 그런 다음 기증자 및 수용자 강도의 상관 관계 변화가 없는 추적을 선택합니다.
단일 단계 광퇴색을 보여주는 기증자 및 수용자 분자를 선택하고 5초 이상 추적합니다. FRET 결핍을 계산하십시오. 마지막으로, 원고에 설명 된 단계에 따라 숨겨진 마르코프 모델링 (HMM)으로 구조적 상태를 식별하십시오.
시아닌 염료에 의한 AZP의 표지는 구리 촉매 고리 첨가 반응에 의해 달성되었으며, 그 결과 548UAA의 효과적인 원형질막 표지가 세포 표면 집단이 공여체 및 수용체 형광단으로 표지되었습니다. SDS-PAGE 전기영동에서, 548UAA를 발현하는 HEK 293T 세포에서 250킬로달톤에서의 단일 밴드가 관찰되었으며, 이는 전장 이량체 mGluR2와 일치하였다. 기증자 및 수용자 표백 이벤트에 대한 여러 단기 및 장기 수명에 대한 대표적인 선택적 추적이 여기에 표시됩니다.
구조적 상태는 HMM 분석을 사용하여 확인되었습니다. 이산 FRET 상태 간의 전환은 이상적인 피팅에서 추출되어 전이 밀도 히트 맵으로 플로팅되었습니다. 이상적인 FRET 추적은 식별된 각 확인에 대한 체류 시간에 대한 정보도 제공합니다.
기증자 및 수용자 채널이 있는 단일 분자의 흔적이 여기에 표시됩니다. 또한, 단일 분자 FRET는 mGluR2 시스테인이 풍부한 도메인의 4 가지 구조적 상태를 나타냅니다. 효율적인 피크 보존은 단일 분자 풀다운에 필수적이며 이 과정에서 주의를 기울여야 합니다.
또한 산소 제거제는 이미징 직전에 첨가해야합니다. 이 표지 방법과 단일 분자 FRET 실험은 여러 수용체에 적용되었으며 수용체 활성화 및 수용체 기능 조절 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.
