Здесь мы использовали одномолекулярный FRET и маркировку белка, специфичного для сайта, с помощью естественного включения аминокислот для изучения конформационной динамики mGluR2. Это позволяет изучать динамику белка, не нарушая структуру белка. Атомная структура обеспечивает статическое изображение белка.
Тем не менее, одномолекулярный FRET позволяет нам визуализировать весь спектр движения белка в режиме реального времени и растворе. Этот метод может быть применен для изучения динамики любого белка. Кроме того, естественное включение аминокислот может быть использовано для изучения белково-белковых взаимодействий и инженерии синтетических рецепторов.
Загрузка образцов и оптимизация визуализации требует терпения и практики. Для начала отметьте маркером отверстия, которые нужно просверлить на стеклянной горке. Используйте Dremel для сверления небольших отверстий на слайде, пока горка погружается в воду.
Обработайте горки и крышку слипами в ацетоне в течение 30 минут в анализаторе ванны при температуре 23 градуса Цельсия. Утилизируйте ацетон с горки и накройте крышкой банки. Тщательно промойте водой и обработайте ультразвуком пятимолярный гидроксид калия в течение 30 минут.
Далее промойте горки и накройте слип водой, а также обработайте метанол ультразвуком в течение двух минут. Оставьте банки, наполненные метанолом, до стадии аминосоления. В горку вылейте свежеприготовленную аминосоленную смесь и накройте банками.
Инкубируйте, обшивайте ультразвуком и снова инкубируйте слайды и крышки в смеси аминосоления, прежде чем выбрасывать раствор. Затем промыть банки метанолом перед заполнением их водой. Затем промойте горки водой.
Высушите их воздушным ударом, и поместите в сборочные коробки. Нанесите 60 миллилитров раствора ПЕГилирования на слайд и поместите поверх него крышку. Отметьте не-PEGylated сторону перед хранением.
После инкубации аккуратно разобрать, промыть горки и накрыть слипы водой. Затем высушите их, выдувая воздухом, и поместите их в стерильную 50-миллилитровую трубку с ПЭГилированной поверхностью, обращенной друг к другу. После прохождения клеток HEK 293T с 0,05% трипсина-ЭДТА, засейте клетки на поли-L/D-лизиновую крышку.
Поместите стандартную среду с АЗФ-дополненной средой для выращивания клеток и метаботропного рецептора глутамата 2 или экспрессии mGluR2. Затем трансфектируют клетки трансфекционным реагентом и инкубируют в течение 24 часов, прежде чем менять среду свежей средой, дополненной AZP. За 20 минут до маркировки алкиновыми цианиновыми красителями дважды вымойте крышку теплым буфером записи или RB и поместите их в теплый стандартный носитель без AZP.
Затем удалите стандартный носитель и промойте ячейки RB перед добавлением свежеприготовленного раствора для маркировки. Инкубировать в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия в темноте. После инкубации удалите раствор для маркировки.
Дважды промыть крышку, содержащую трансфектированные клетки, и повторно суспендировать в той же среде. Затем гранулируют клетки, вращаясь при 1000 г при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, и удаляют надосадочный материал перед повторной приостановкой гранулы в 80-130 микролитрах раствора лизиса. Разбейте гранулу путем пипетки.
Затем заверните его в фольгу и поместите на коромысло при четырех градусах Цельсия на 30 минут до одного часа, чтобы лизировать клетки. Гранулируют нерастворимую фракцию центрифугированием при 20 000 г и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Затем переложите супернатант в свежую холодную трубку и храните его на льду.
Извлеките слайд и крышку из морозильной камеры и дайте им нагреться при комнатной температуре в темноте. Соберите камеру, зажав полоски двусторонней ленты между слайдом и крышкой, гарантируя, что ПЭГилированные поверхности образуют внутреннюю часть проточной камеры. Используя наконечник пипетки, нажмите на крышку, чтобы убедиться, что лента соприкасается с крышкой и скользит.
Нанесите эпоксидную смолу на края слайда. Нанесите 40 микролитров 500-наномолярного NeutrAvidin на каждую полосу и инкубируйте внутри увлажненной темной коробки. Через две минуты промыть каждую полосу камеры 100 микролитрами буфера T50.
Затем добавляют 20 наномолярных растворов биотинилированных антител и инкубируют в течение 30 минут перед промывкой с 200 микролитрами буфера Т50 на полосу. Включите компьютер и микроскоп. Затем включите лазеры, чтобы разогреться.
Затем включите камеру EMCCD и откройте программное обеспечение. Установите камеру образца на ступень микроскопа и постепенно добавляйте образец белка, чтобы достичь примерно 400 молекул на поле зрения. Промывайте камеру 100 микролитрами буфера визуализации, дополненного 0,3 единицами протокатехуата 3, 4-диоксигеназы.
Отрегулируйте коэффициент усиления, скорость захвата и мощность лазера для обнаружения одномолекулярных флуоресцентных сигналов как в донорском, так и в акцепторном каналах. Затем возбуждают донора, и приобретают временные следы до тех пор, пока 80% молекул донора в поле зрения не будут фотоотбелены. В конце фильма включите 640-нанометровый лазер, чтобы непосредственно возбуждать акцептор до тех пор, пока некоторые молекулы не будут фотоотбелены.
Измените поле зрения и повторите шаги для возбуждения донора и акцептора, чтобы собрать по три фильма на каждое условие. Для выбора одномолекулярных следов FRET при отборе частиц выберите следы, где общая интенсивность следов донора и акцептора стабильна с течением времени. Затем выберите следы с антикоррелированными изменениями интенсивности донора и акцептора.
Выберите молекулы-доноры и акцепторы, показывающие одноступенчатое фотоотбеливание и следы длиной более пяти секунд. Рассчитайте дефицит FRET. Наконец, определите конформационное состояние с помощью скрытого марковского моделирования, или HMM, выполнив шаги, описанные в рукописи.
Маркировка AZP цианиновыми красителями была достигнута реакцией циклоприсоединения, катализируемой медью, и привела к эффективной маркировке плазматической мембраны 548UAA с популяцией клеточной поверхности, помеченной донорскими и акцепторными флуорофорами. При электрофорезе SDS-PAGE в клетках HEK 293T, экспрессирующих 548UAA, наблюдалась одна полоса при 250 килодалтонах, экспрессирующих 548UAA, что совпало с полноразмерным димерным mGluR2. Здесь показаны репрезентативные селективные следы для множественных кратковременных и долгоживущих для доноров и акцепторов отбеливания.
Конформационные состояния были идентифицированы с помощью анализа HMM. Переходы между дискретными состояниями FRET были извлечены из идеализированных припадков и построены в виде тепловой карты плотности перехода. Идеализированные следы FRET также дают информацию о времени ожидания для каждого идентифицированного подтверждения.
Здесь показаны следы одной молекулы с донорским и акцепторным каналами. Кроме того, одномолекулярный FRET выявляет четыре конформационных состояния домена, богатого цистеином mGluR2. Эффективное сохранение пика имеет важное значение для вытягивания одной молекулы, и во время этого процесса следует проявлять осторожность.
Кроме того, кислородопоглощающий агент должен быть добавлен непосредственно перед визуализацией. Этот метод маркировки и одномолекулярные эксперименты с FRET были применены к нескольким рецепторам и дали новое представление о механизме активации рецепторов и модуляции функции рецептора.
