מחקר וירוס הפטיטיס E כבר קשה על ידי היעדר מערכת תרבות תאים יעילה. הטכניקות שלנו מתגברות על מגבלות אלה וסוללות את הדרך לעיצוב תרופות ופיתוח חיסונים. עם פרוטוקול זה, אנו מסוגלים לייצר וירוסים טיטר גבוה זיהומיות של חלקיקי HEV שאינם מעטפה ומעטפה, להקל על זיהום של מגוון רחב של תאים.
ביצוע פרוטוקול זה דורש גישה למתקן BSA-2 וניסיון בטכניקות בסיסיות של תרבות תאים. כדי להפוך את הדנ"א הפלסמיד ליניארי, יש לערבב 10 מיקרוגרם של הדנ"א של התבנית עם 10 מיקרוליטרים של חיץ ושני מיקרוליטרים של אנזים הגבלת המיקרוקוקוס לוטוס ולהתאים את הנפח הסופי ל-100 מיקרוליטרים במים. ואז לה הדגיר את הפתרון במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ולאשר ליניאריזציה של פלסמיד על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
לאחר בידוד DNA פלסמיד ליניאריזציה, ההצלחה של ליניאריזציה ניתן לאמת על ידי השוואת ה- DNA פלסמיד לא מתעכל ל- DNA פלסמיד מתעכל על ידי אלקטרופורזה ג'ל. לקבלת תמלול במבחנה של הדנ"א המטוהר, באורך מלא של נגיף הפטיטיס E, יש לערבב שני מיקרוגרם של תבנית הדנ"א ליניארית עם חברי ההנהלה המתאימים ולהשתמש במים נטולי גרעין כדי להביא את הנפח הסופי של הפתרון ל-100 מיקרוליטרים. לאחר ערבוב יסודי, הדגירה את הפתרון במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס.
לאחר שעתיים, מוסיפים שני מיקרוליטרים נוספים של פולימראז T7 RNA לצינור. לאחר מכן מערבבים את התגובה ו דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים נוספות. בסוף הדגירה, לעכל את תבנית ה-DNA הראשונית עם 7.5 microliters של DNAs עם ערבוב יסודי דגירה במשך 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
לאחר החילוץ, בזהירות לבדוק את שלמות RNA ותפוקה על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. במקרה של RNAs נמוך abundancy, להקות נפרדות, ולא כתם מטושטש יש לצפות. חלק מהצעדים דורשים ביצוע מהיר ולכן הכנה יסודית.
כמו כן, לשים לב במיוחד שלמות RNA וכדאיות התא. כדי להכין תאים סרטניים בכבד האנושי לייצור וירוס הפטיטיס E שמקורו בתרבות התאים, זרע את התאים ב 20 מיליליטר של DMEM מלא על צלחת תרבות מצופה קולגן 15 ס"מ ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים 90% confluency. בסוף התרבות, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של PBS לפני ניתוק אותם מצלחת תרבות התא עם שלושה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס.
תן שימוש חוזר בתאים המנותקים ב-10 מיליליטר של DMEM מלא ותעביר את התאים לצינור חרוט של 50 מיליליטר לספירה. להעביר חמש פעמים 10 לשישה תאים לצינור חדש 50 מיליליטר ולשטוף את התאים פעמיים עם 35 מיליליטר של PBS לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, מניחים את התאים על הקרח מבלי להסיר את העל-טבעי.
עבור אלקטרופורציה של תאי היעד, תוספת 384 microliters של ציטומיקס עם שני ATP מילימולר וחמישה גלוטתיון מילימולרי, לאחר מכן לאחסן על קרח עד שימוש נוסף. בזהירות להחליף את supernatant עם כל 400 microliters של פתרון. הוסף חמישה מיקרוגרם של רנ"א גנומי נגיפי מטוהר לתאים והעבר את ההשעיה התאית לקובט ארבעה מילימטרים לאלקטרופורציה ב 975 מיקרופאראד ו 270 וולט עבור 20 אלפיות שנייה.
לאחר אלקטרופורציה, להשתמש פיפטה פסטר להעביר את התאים מהר ככל האפשר לתוך 11 מיליליטר של DMEM מלא וזרע 10 מיליליטר של התאים אלקטרופולציה לתוך צלחת תרבות 10 ס"מ מצופה קולגן. לאחר מכן, להוסיף 1.3 פעמים 10 לתאים החמישיים ב 300 microliters של בינוני באופן שווה על להחליק כיסוי באר אחת של צלחת 24 microtiter מצופה קולגן ולהמקם את הצלחת ואת המנה באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות. למחרת, להחליף את supernatant בצלחת עם 10 מיליליטר של DMEM טרי ולהחזיר את המנה אינקובטור תרבות התא במשך שישה ימים נוספים.
ביום החמישי עד השביעי, בהתאם לצפיפות התא, לבצע כתמים immunofluorescent של בקרת transfection כדי לאפשר חישוב של מספר התאים המבטאים את חלבון היעד של עניין מנורמל למספר הכולל של תאים. אלקטרופוזיה מוצלחת יכולה להיות מנוטרת על ידי כתמים immunofluorescent של בקרת ההמרה. יעילות ההמרה צריכה לחרוג מ- 40%A מוטציה חסרת שכפול יכולה לשמש כפקד שלילי כדי לאשר את הספציפיות של הכתם.
כדי לקצור חלקיקי וירוס הפטיטיס E חוץ-תאיים שמקורם בתרבות התאים, ביום השישי, סנן את העל-טבעי דרך רשת מיקרוליטר של 0.45 כדי להסיר פסולת תאים ולאחסן את נגיף הפטיטיס E הנקצר הנגזר מתרבות התאים החוץ-תאיים בארבע מעלות צלזיוס. עבור קציר חלקיקי נגיף הפטיטיס E שמקורו בתרבות תאית, שטפו תאים עם PBS וניתקו את התאים עם 1.5 מיליליטר של 0.05%Trypsin-EDTA ב-37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים התנתקו, לעצור את התגובה עם 8.5 מיליליטר של DMEM ולהעביר את ההשעיה התא לצינור 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה.
הוסף 1.6 מיליליטר של DMEM להשלים בינוני לכל אלקטרופורציה בודדים שני צינורות תגובה מיליליטר ולהשתמש 800 microliters של המדיום כדי resuspend התאים, ובכך להעביר את התאים לצינורות. להקפיא את התאים החוצה חנקן נוזלי, ולאחר מכן להפשיר את התאים על קרח שלוש פעמים לפני צנטריפוגה במהירות גבוהה lysates וכתוצאה מכך במשך 10 דקות ב 10, 000 פעמים גרם. ואז להעביר את supernatants לתוך צינורות חדשים מבלי להפריע כדורי פסולת התא עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון.
כדי להעריך את titers של מלאי נגיף הפטיטיס E המיוצר לאחרונה חוץ תאית, זרע פעמיים 10 לארבעת התאים לכל 100 microliters של MEM לתוך 60 בארות מרכז של צלחת מיקרוטיטר מצופה קולגן 96 היטב ולמלא את בארות החיצוניות ביותר עם 100 microliters של PBS לבא. לאחר 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף 50 microliters של חלקיקי וירוס חוץ תאיים על טבעי לשורה הראשונה של תאים. לאחר ערבוב יסודי, לדלל באופן סדרתי את תוכן הבאר שש פעמים בריכוז אחד עד שלושה ל הבאר על ידי העברת 50 microliters של supernatant מן השורה הקודמת לשורה הבאה של תאים כפולים עד השורה האחרונה של תאים.
כדי להדביק את התאים עם חלקיקי וירוס הפטיטיס E שמקורם בתרבות תאית, להוסיף 25 microliters של חלקיקי וירוס תאיים על טבעי לשורה העליונה של תאים ומערבבים היטב לפני דילול סדרתי של התאים שש פעמים ביחס של אחד עד חמישה עם 25 microliters של דילול כפול כפי שהוכח. לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך שבעה ימים לפני כתמים immunofluorescent על פי הפרוטוקול בכתב היד. לאחר הדגירה וכתמים חיסוניים, ניתן לנתח את הצלחות באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence.
לאחר כשל חיסוני ניתן לחשב את הטיטר הסופי של החלקיקים האינטראקטיביים והחוץ-תאיים באמצעות הנוסחה המתאימה כפי שצוין. לאחר זיהום תא היעד עם חלקיקי וירוס E שמקורם בתרבות התא על ידי דילול סדרתי, titers בין אחד פעמים 10 לחמישי ושלוש פעמים 10 כדי שש יחידות היוקד להרכיב למיליליטר ניתן לצפות מתרבות התא נגועים חלקיקי נגיף הפטיטיס E שאינם עטופים בתרבות תאית. בתרבויות נגועות בחלקיקי וירוס הפטיטיס E המופקים מתרבית תאים חוץ-תאיים עטופים, צפויים טיטרים בין פעם אחת 10 לשניה ו-10 פעמים להתמקדות הרביעית ויוצרים יחידות למיליליטר.
בנוסף, היחס בין עותקי גנום וחלקיקי וירוס זיהומיות תאיים שאינם עטופים הוא בדרך כלל נמוך יותר מזה שנצפה עבור תרבויות נגועות בנגיף הפטיטיס E המופק מתרבות חוץ-תאית, מה שמרמז על זיהום ספציפי גבוה יותר של מיני נגיף הפטיטיס E שאינם עטופים. ייצור חלקיקים ויראלי וזיהום תאי יעד דורשים מחזור חיים ויראלי מלא, והוא יכול לספק תובנות חדשות על אינטראקציות בין מארח וירוסים. פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לבצע קינטיקה שכפול או לייצר חלקיקים שניתן להשתמש בהם ב- assays זיהום.
רוב המחקר שלנו תלוי כיום בחלקיקים זיהומיות, הן ב- HEV האפוי והן ב- HEV שאינו עטוף. ומאמרים המשתמשים בטכניקות שלנו מתפרסמים כעת.
