פרוטוקול זה מאפשר זיהוי ובידוד של אבות אריתרואידים מסוג BFU-E ו-CFU-E ישירות מרקמת עכבר שזה עתה נקטפה כמו מח עצם וטחול. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים לבודד אוכלוסיות טהורות של אבות אריתרואידים, דבר שלא היה אפשרי עם פרוטוקולי הזרימה הקודמים. שיטה זו משפרת מאוד את יכולתנו לחקור מודלים של עכברי מחלות אריתרואידים בכך שהיא מאפשרת בידוד אבות לניסויים רבים במורד הזרם.
כדי להתחיל, הניחו את עצם הירך והטיביה שזה עתה נותחו ישירות לתוך חיץ מכתים קר או SB-5 והשאירו את הצינורות על הקרח עד שיהיו מוכנים לחילוץ מח העצם. מניחים טיט מעוקר נקי על קרח בדלי ומעבירים את העצמות לטיט. בעזרת מספריים לנתיחה, יש לחתוך קצוות של כמילימטר אחד מכל עצם.
השתמש במזרק 3 מיליליטר המצויד במחט 26 מדים המכילה SB-5 כדי לשטוף את המוח מהעצמות ולאסוף אותו לתוך חומר המליטה ולחזור על התהליך 3 עד 5 פעמים באמצעות חיץ טרי בכל פעם עד שהעצמות נראות חסרות צבע. מסננים את המח הסמוק דרך רשת של 100 מיקרומטר ואוספים את התאים בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר המונח על קרח. לאחר מכן, השתמש בטיט ובמזיק כדי למחוץ את העצמות הסמוקות ב 5 עד 10 מיליליטר של SB-5.
מסננים את תערובת העצמות המרוסקות וחוצץ דרך מסננת התאים בגודל 100 מיקרומטר כדי להצטבר עם התאים שנאספו בעבר. הגדר מסנן רשת של 100 מיקרומטר על צינור צנטריפוגה ריק של 50 מיליליטר המונח על קרח. מניחים טחול בודד על מסנן הרשת ומוסיפים 0.5 עד 1 מיליליטר של SB-5 לטחול כדי להבטיח שהוא לא יתייבש.
באמצעות צד הגומי של בוכנה מזרק 3 או 5 מיליליטר, מועכים את הטחול דרך הרשת. מוסיפים עוד SB-5, 5 מיליליטר בכל פעם, וממשיכים למעוך עד שכל התאים נאספו בצינור. הכן תרחיף חד-תאי על-ידי צנרת מעלה ומטה של התאים שנאספו עם 2 מיליליטר של SB-5 באמצעות קצה פתח גדול.
הכתימו את הפלואורסצנציה מינוס אחד או FMO על ידי הוספת כל הנוגדנים למעט הנוגדן הנושא את שמו של ה- FMO לתרחיף התאים בצינור FACS. כדי להכתים את הפקדים בצבע יחיד, הוסף נוגדן יחיד לתרחיף התאים בצינור FACS. מערבולות כל צינור בקרה במשך 2 עד 3 שניות ב-3000 סל"ד ולאחר מכן דגירה ב-4 מעלות צלזיוס מתנדנדת במשך 2.5 שעות בחושך.
לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם SB-5 ולהפוך את נפח ההשעיה התא ל 4 מיליליטר עם SB-5. סובבו את התאים ב-900 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ושאפו את הסופר-נטנט. השעה מחדש את הפקדים הלא מוכתמים ואת כל הפקדים בצבע יחיד ב-300 מיקרוליטרים של SB-5 וסנן דרך רשת מסנן של 40 מיקרומטר לצינורות FACS חדשים.
בצע פתרון DAPI SB-5 על ידי דילול מלאי DAPI ביחס של 1 עד 10, 000 ב- SB-5. השעה מחדש את ה-FMOS ב-1.8 מיליליטר של DAPI SB-5 ובקרת צבע יחיד של DAPI ב-300 מיקרוליטרים של DAPI SB-5, ולאחר מכן סנן אותם דרך רשת סינון של 40 מיקרומטר לתוך צינורות FACS חדשים. לאחר הוספת תערובת מאסטר הנוגדנים לכל דגימה, מערבבים את הצינורות במשך 2 עד 3 שניות ב-3000 סל"ד ולאחר מכן דגירה ב-4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 2.5 שעות במצב נדנדה.
לאחר שטיפת התאים כפי שהוכח קודם לכן, השהה מחדש את הדגימות ב-1.8 מיליליטר של DAPI SB-5 וסנן דרך רשת מסנן של 40 מיקרומטר לתוך צינור FACS חדש ונתח את הדגימות באמצעות ציסטומטר. השתמש בפיזור הקדמי כדי להסיר את הפסולת בהתבסס על גודל, ולאחר מכן השתמש בהיסטוגרמה של גובה הפיזור קדימה לעומת היסטוגרמה של אזור הפיזור קדימה כדי לא לכלול צברי תאים ולבחור תאים בודדים. חזור על ההחרגה עם גובה הפיזור הצדדי לעומת ההיסטוגרמה של אזור הפיזור הצדדי.
אל תכלול את התאים המתים על-ידי מיון התאים החיוביים עבור DAPI. בחר את השושלת שלילית TUR אחד 19 תאים חיוביים הערכה שלילית. ומתוך אלה בחר תת-אוכלוסייה המבטאת CD 55.
חלקו את השושלת השלילית TUR 19, ערכה שלילית, חיובית, CD 55 תאים חיוביים ל-2 אוכלוסיות עקרוניות, P 6 ו-P 7 בהתבסס על הביטוי של CD 49 F ו-CD 1 0 5. כעת, בהתבסס על הביטוי של CD 150 ו-CD 41, חלק את P 6 בהמשך ל-P 3, P 4 ו-P 5. באופן דומה, בהתבסס על הביטוי של CD 150 ו- CD 71, חלק את P 7 בהמשך ל- BFUE, CFUE מוקדם ו- CFUE מאוחר.
במחקר הנוכחי זוהו יחידות יוצרות פרץ ומושבה מתאי מח העצם והטחול שזה עתה נקטפו. לאחר 72 שעות של אריתרופואיטין, או הזרקת רכב בעכברים, גירוי אריתרופואיטין הראה התרחבות של אוכלוסיות יחידות היוצרות את המושבה המוקדמת והמאוחרת P 1 נמוך ו- P 1 גבוה בתאי מח העצם והטחול שנקטפו. התגובה של מח העצם ואבות הטחול לאריתרופואיטין in vivo הראתה גם מספר גבוה יותר של תאים במושבה המוקדמת והמאוחרת היוצרים אוכלוסיות יחידות P 1 נמוך ו- P 1 גבוה, בהשוואה לבקרת כלי רכב.
חשוב ביותר ליצור תרחיף של תא בודד לפני תיוג התאים בנוגדנים. ניתן להשיג זאת על ידי צנרת למעלה ולמטה שוב ושוב ועל ידי הכללת EDTA במאגר. אבות האב המטוהרים יכולים לשמש לכל אנליזה תאית ומולקולרית במורד הזרם.
לדוגמה, תעתיק תא בודד, אטסק, מבחני מושבה וביוכימיה. טכניקה זו סייעה לנו לבחון את התחזיות מניסויי RNA-seq חד-תאיים.
