מחקר זה הוא מערכת פשוטה, רב-תכליתית וקלה לבחינת השפעות פוטודינמיות שונות על מיקרואורגניזמים ותאים שונים. במערכת זו, ניתן להתאים את הנורית לסידור שונה בהתאם לתכנון הניסוי. ניתן לחשב מצב שונה של PDT בלוחית של 96 בארות או אפילו בצלחת של 384 בארות בניסוי אחד.
טכניקה זו יכולה לשמש לטיפול קרטיטיס פטרייתית שבגללה ברחבי העולם, סביב 150, 000 אנשים מאבדים את עיניהם למרות טיפולים אינטנסיביים. כדי להתחיל, חותכים ארבע נורות LED ירוקות מרצועת LED ומיישרים אותן עם שלוש בארות של צלחת של 96 בארות. מדוד את קצב הפלואנס של ה- LED ב- 540 ננומטר באמצעות מד הספק אור.
שמרו על טמפרטורה קבועה של 25 מעלות צלזיוס עם מאוורר חשמלי שהורכב לצד הצלחת במהלך ההקרנה. עם לולאה סטרילית, בחרו מושבה אחת של קנדידה אלביקנים מתוך צלחת אגר והוסיפו אותה לצינור זכוכית מעוקר המכיל שלושה מיליליטרים של מדיום YPD. דגירה של הצינור ב-25 מעלות צלזיוס במהירות סיבוב של 155 סל"ד למשך 14 עד 16 שעות כדי לגדל את תרבית השמרים.
לאחר מכן לדלל את תרבות הלילה עם מדיום YPD לערך OD 600 של 0.5. דגירה ב-30 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-155 סל"ד למשך ארבע שעות כדי להשיג את שלב צמיחת היומן. חזור על הדילול של תרבות שלב היומן עם מדיום YPD טרי לערך OD 600 של 0.65, כדי להגיע בערך פי 10 ליחידות יצירת המושבה השביעית למיליליטר.
בו זמנית להכין פתרון מלאי של 4% של בנגל עלה ב 1X PBS. מסנן לעקר עם מסנן 0.22 מיקרומטר. הוסיפו 111 מיקרוליטרים של תמיסת ורדים בנגלית של 2% למיליליטר אחד של תרבית פאזה של לוג, ותרבית משותפת בנקודות זמן שונות בטמפרטורת החדר כדי להבין את ספיגת ה-RB בתאים.
צנטריפוגה ב 16, 100 פעמים G במשך 2 1/2 דקות בטמפרטורת החדר, ולשטוף את התרבות המשותפת שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 1X PBS. לאחר הכביסה, יש להחיות את תרבות קנדידה אלביקנס במיליליטר אחד של 1X PBS. עבור כל מצב, פזרו את התרבות לשלוש בארות שונות בצלחת של 96 בארות.
יישרו את הבארות עם מערך ה-LED. בקבוצות החשופות באור, הפעילו את המאוורר החשמלי ואת האור. לאחר הקרנה, בצע דילולים סדרתיים פי עשרה פעמיים על ידי לקיחת 20 מיקרוליטרים של תמיסת התרבית המשותפת מבאר אחת, והוספתו לצינור המכיל 180 מיקרוליטרים של 1X PBS.
לאחר מכן שחררו 20 מיקרוליטרים של כל דילול סדרתי ברביע אחד של לוחית אגר YPD כדי להשיג מושבות הניתנות לספירה על הצלחת. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הראתה צביעה מיידית של קנדידה אלביקנס עם בנגל ורדים תחת פלואורסצנציה אדומה. לאחר 15 דקות של דגירה, רוב התאים הוכתמו בשומן ורדים, מה שמעיד על כך שהוא נכנס לתאים באופן תלוי זמן.
יתר על כן, הפעלה של ורד בנגל עם אור מייצרת רדיקלים חופשיים וחמצן סינגלט בתאים, וכתוצאה מכך מוות תאי. בהיעדר ורדים או הקרנה, לא נצפה מוות תאי. קנדידה אלביקנס עוכבה לאחר הקרנת אור ירוק בנוכחות עלייה של 0.2% בבנגל באופן תלוי מינון קל.
חשוב כי תחילה יש ליישר את לוחית 96 הבאר עם מרכז הנורית. שנית, יש לייבש היטב את צלחת האגר המשמשת כדי למנוע ערבוב של מושבות נפרדות. ניתן לשלוח עוד יותר את אלביקנים קנדידה שגדלו על הצלחת לניתוח גנים, מה שיכול לענות על האופן שבו PDT משפיע על ביטוי הגנים של התאים.
טכניקות אלה סוללות את הדרך לבחון כיצד PDT פועל על סוגי תאים שונים, בין אם תאים סרטניים, חיידקים, פטריות או וירוסים באמצעות פלטפורמה קלה, זולה ורב-תכליתית.
