הפרוטוקול שלנו שילב מספר טכניקות שהוכחו כיעילות לתחזוקת אורגנואידים לטווח ארוך. זה שימושי לחקר הזדקנות במחלות הקשורות לגיל שבהן ביטויים קליניים הם מחוץ לתקופה ההתפתחותית. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי זה לא דורש כל ציוד מיוחד או ריאגנטים.
הוא מבוסס במידה רבה על חומרים שנמצאים בדרך כלל במעבדה. הזדקנות ומחלות נוירודגנרטיביות הפכו לנקודת עניין מיוחדת מכיוון ששיטות המידול הנוכחיות שלנו מתמקדות בעיקר בפנוטיפים של מחלות מבוססות ולא בשלבי ההתפתחות המוקדמים. תאי גזע עובריים ותאי גזע מושרים הם תאים עדינים מאוד.
משתמשים בפעם הראשונה צריכים להיות עדינים ולהיות סבלניים. מכיוון שמדובר בתרביות ארוכות טווח, יש להתאזר בסבלנות מההתחלה כדי להתחיל, רססו 70% אתנול על גדיל תפר והכינו מיקרופילמנטים PLGA על ידי שחיקת גדיל התפר עם הקצה הקהה של האזמל. מניחים את הסיב מתחת למיקרוסקופ.
ובאמצעות סרגל, להתחיל לחתוך את הסיב לשברים של 500 מיקרומטר עד מילימטר אחד ארוך גדילים. חותכים כ -25 מ"מ מהסיבים בסך הכל ומוסיפים את החוטים בצינור 15 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקוטית. לאחר מכן במכסה המנוע, דללו את תמיסת הסיבים עם 10 מיליליטר של DMEM/F-12 ומערבולת כדי לערבב היטב.
לאחר מכן, להוסיף 20 מיקרוליטר של פתרון סיבים לשלוש בארות של צלחת 96 באר. באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, לספור ולממוצע את הסיבים לכל באר. לדלל או לרכז את הבארות עם תמיסת סיבים בממוצע 5 עד 10 microfilaments לכל באר.
לאחר שתאי הגזע הפלוריפוטנטיים המושרים שהושרו בעבר בתרבית הגיעו למפגש של 70% עד 80%, בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 10 או 20. ודא שהמושבות מציגות פחות מ -10% שטח של בידול ספונטני. שואפים את המדיום עם פיפטה ולשטוף את התאים פעם אחת עם DPBS.
לאחר מכן, להוסיף 500 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים או 0.5 מילימולר EDTA כדי לנתק את המושבות, ולדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיית E8 טרייה לכל באר ופיפטה בעדינות כדי לנתק את כל התאים. מעבירים את כל מתלה התא לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר, ומוסיפים עוד מיליליטר אחד של מדיה E8 טרייה.
לאחר מכן, סובבו את התאים ב 290 גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסופרנטנט, יש להשהות מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיה E6 בתוספת מעכב ROCK מיקרומולרי 50 ולספור את התאים באמצעות המוציטומטר. הכינו מתלה תאים בצפיפות הישיבה הרצויה במדיית E6 בתוספת מעכב ROCK.
לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת חיבור 96 באר נמוכה במיוחד. לאחר מכן, צנטריפוגו את הצלחת ב 290 גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר כדי לאלץ את צבירת התאים. לאחר מכן, דגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 5% פחמן דו חמצני ליצירת גוף עוברי.
לאחר 24 שעות של דגירה, להעביר את הצלחת למכסה המנוע בזהירות לשאוף 120 מיקרוליטר של התקשורת באמצעות פיפטה, נזהר לא לשאוף את הגוף העוברי על ידי הורדת קצה פיפטה רחוק מדי לתוך הבאר. לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של מדיה E6 טרי בתוספת שני XAV939 micromolar, ואת מעכבי SMAD לכל באר. מעבירים את הצלחת חזרה לאינקובטור ומחליפים את המדיום מדי יום ב-E6 טרי בתוספת המעכבים.
ביום השביעי של הדגירה, בדקו אם כל גופי העובר הגיעו לקוטר של 550 עד 600 מיקרומטר ומציגים קצה חלק וברור. בשלב זה, הם מוכנים להיות מוטבע במטריצה חוץ-תאית. כדי להטמיע את האורגנואידים, הכינו יריעות הטבעה על ידי הנחת יריעת סרט תקרה תרמופלסטית באורך ארבעה אינץ' על קופסת P200 ריקה.
לאחר מכן, השתמש בצינור חרוטי של 15 מיליליטר או בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 500 מיקרוליטר ולחץ בעדינות על יריעת הסרט לתוך החורים כדי ליצור 12 או את מספר הגומות הרצוי. לאחר מכן, רססו 70% אתנול על יריעת הסרט ותנו לו להתייבש בתוך מכסה המנוע עם אור UV דולק למשך 30 דקות לפחות. בינתיים, הפשירו כמות מספקת של מטריצת קרום מרתף על קרח.
לאחר מכן, באמצעות קצה P200 רחב משעמם, להעביר גוף עוברי אחד מן הצלחת 96 באר לכל גומה. הסר מדיה רבה ככל האפשר עם קצה פיפטה רגיל אך אל תיתן לגוף העובר להתייבש. לאחר מכן, עם קצה P200 רגיל מקורר מראש, להוסיף כ -30 מיקרוליטר של מטריצת קרום לא מדולל לכל אורגנואיד, להבטיח כי גוף העובר הוא קרוב ככל האפשר למרכז הטיפה.
לאחר שכל הגופים העובריים מוטמעים במטריצה, הניחו את יריעת הסרט בצלחת פטרי סטרילית. לאחר מכן, דגרו על צלחת הפטרי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באווירה לחה עם 5% פחמן דו חמצני כדי לאפשר למטריצת הממברנה להתמצק. להתמיינות אורגנואידים, יש להוסיף חמישה מיליליטר של מצע ההתמיינות המוכן עם B-27 ללא ויטמין A לבאר אחת של צלחת 6 בארות חיבור נמוכה במיוחד.
מחממים את הצלחת ל-37 מעלות באינקובטור. לאחר שמטריצת הממברנה התמצקה, העבירו את גופי העובר המשובצים לצלחת בעלת 6 הבארות על ידי דחיפת הגומות מהחלק האחורי של יריעת הסרט. במידת הצורך, השתמשו במיליליטר אחד של מדיה מהבאר והכניסו אותו ליריעה כדי לנתק את הטיפות מיריעת הפילם.
הגופים העובריים המשובצים במטריצת הממברנה התמינו לכיוון אורגנואידים מוחיים המציגים תצורות ניצנים ברורות ביום במבחנה 10. ביום במבחנה 30, אורגנואידים מבשילים עוד יותר באמצעות גומה או הטבעה של כריך. תרבית ארוכת טווח מראה אורגנואידים מוחיים שגדלו לגדלים משמעותיים.
ביום השביעי במבחנה, גופים עובריים מציגים רוזטות עצביות חיוביות SOX2, נוירונים לא בוגרים מפוזרים ותאי אב עצביים. בעוד שביום במבחנה 120, הם מציגים סמנים עצביים בוגרים כגון MAP2 ו- NeuN. ניתן להשתמש בסמנים ציטו-שלדיים אלה בשילוב עם סמנים פוסט-מיטוטיים אחרים כגון דו-קורטין וסינפסין כדי לבדוק פלסטיות סינפטית וירידות אחרות הקשורות לגיל, כמו גם רקמת מוח נוספת כמו אסטרוציטים וגליה.
הקפדה על כך ששולי הרקמה יישארו שלמים היא קריטית. כדי למזער את כוח הגזירה המזיק, הצנרת צריכה להיעשות לאט, למשל, תוך שינוי מדיה והטבעה אורגנואידית. ההאטה בצמיחת האורגנואידים מאפשרת לנו לחקור את התקדמות המחלה בביטויים תאיים מוקדמים.
יצירת אורגנואידים סוללת את הדרך לגילוי מוקדם בטיפול במחלות רבות.
