מחקר זה מדגים גישה חדשנית לחקר טיפולים בסרטן התוספתן ופתולוגיה במסגרת פרה-קלינית. שיטות אלה עשויות להיות ישימות באופן רחב יותר לחקר ממאירויות אחרות. סרטן התוספתן קשה למחקר לאור שכיחותו הנמוכה בהיעדר תוספתן בעכברים למידול מחלות.
טכניקה זו מאפשרת ללמוד אינטראקציות תאים בתוך microenvironment הגידול. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את הביולוגיה של סוגים מרובים של סרטן שיש להם נטייה לשלוח גרורות omentum, כגון סרטן המעי הגס והשחלות. התחילו בהכנת אמצעי התחבורה והתרבות.
עם הגעת הרקמות, להעביר את רקמות הגידול pseudomyxoma peritonei לתוך 35 DMEM מלא המכיל שישה ס"מ קוטר צלחות. בנוסף להסרת כל מוצין נוזלי, או אזורי רקמה מאוד mucinous, להסיר כל רקמה כי קשה לחתוך עם אזמל. חותכים גושים ברקמת הגידול בערך לקובייה אחת סנטימטר חתיכות קטנות יותר.
להכנת אגרוז והטמעת רקמות, הכינו תמיסה של 5% של אגרוז נמס נמוך ב- PBS ללא נסיוב בקר עוברי או FBS באותו יום אם מגיעים רקמות. הוסיפו את תמיסת האגרוז הנוזלית 5% לצלחות של שישה סנטימטרים המכילות שתיים עד שלוש דגימות גידול קטנות יותר עד שהיא מכסה את הדגימה. מניחים את הרקמות המשובצות במקרר ארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
פורקים את דגימות הרקמה על הוויברטום, מוציאים את האוגר המוצק מהמקרר, וחותכים את קוביות האגרוז מעט גדולות יותר מרוחב הרקמה באמצעות אזמל. מרחו דבק-על על שלב הוויברטום, והניחו בעדינות את קוביית האגרוז על דבק העל למשך דקה עד שתיים לצורך קיבוע. קבע את הלהב לוויברטום, והגדר את עובי קטע הרקמה לכ- 150 עד 250 מיקרון להדמיה אופטימלית במורד הזרם.
כדי לגדל את פרוסות הרקמה, להכין צלחת חדירה על ידי הוספת שני מיליליטר של מדיה DMEM מלאה מעל הממברנה חדירה ושלושה מיליליטר מתחת לקרום חדיר. לאחר מכן, הרימו בעדינות את פרוסות הרקמה מתא החיתוך של הוויברטומה באמצעות מברשת צבע דקה, והניחו שתיים עד ארבע פרוסות בכלי תרבית חדירים המכילים DMEM מלא. קוצצים את הפרוסות עד שבעה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני.
במהלך החלפת מדיה, כל 24 שעות, להוסיף bortezomib כמו פקדים להרוג תאים, וכימותרפיה לבדיקה 5-Fluorouracil, או 5-FU, למדיה תרבית לבצע התערבות פרמקולוגית. הניחו פרוסות גידול לניתוח הדמיה קונפוקלית בבאר אחת של צלחת בת 12 בארות המכילה PBS עם 1% FBS. עבור ניסויי הדמיית סידן, במקום PBS, לדגור על הפרוסות בתמיסת סידן תאית נוספת.
דגימות כתמים עם צבעי הדמיה כדי לקבוע את הכדאיות של פרוסות רקמה. יש לדגור במשך 10 דקות עד שעה לאחר הוספת צבע הכדאיות. לאחר הדגירה, מעבירים את הפרוסות לצלחת פטרי עם תחתית זכוכית שקופה אופטית המכילה PBS עם 1% FBS לשימוש להדמיה במכשיר הדמיה קונפוקלית.
חותכים חתיכה קטנה מקצה קצה פיפטה של מיליליטר אחד כדי להרחיב את הפתח, מה שמאפשר דיסוציאציה מכנית נמרצת על ידי פיפט. דגירה על פרוסות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב במשך חמש עד 15 דקות במיליליטר אחד של חיץ עיכול, עם הפרעה נמרצת לרקמות פעמיים עד שלוש במהלך הדגירה באמצעות דיסוציאציה מכנית. לאחר עיכול הרקמה, העבירו את הרקמה המשובשת עם חומר העיכול על גבי מסנן של 70 מיקרומטר המונח על גבי צינור חרוטי של 50 מיליליטר.
בחרו חתיכות גדולות יותר באמצעות מלקחיים סטריליים או פיפטה. בעזרת הקצה האחורי הקהה של מזרק פלסטיק של חמישה מיליליטר, מעכו פרוסות גדולות יותר ולא מנותקות ושטפו אותן עם ארבעה מיליליטר PBS המכילים 2% FBS. קח את supernatant התא מנותק צנטריפוגה ב 300G במשך חמש עד 10 דקות.
הסר את supernatant ולשטוף את הגלולה עם מיליליטר אחד של PBS המכיל 2% FBS. כדי להכין את הדגימה לציטומטריית זרימה, הוסיפו את מאגר החסימה המכיל 50 מיקרוליטר של בלוק FC אנושי, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. בצע צביעה תאית נוספת באמצעות הנוגדנים המתאימים ב 50 מיקרוליטר של PBS המכיל 2% FBS.
Aliquot חמישה מיליליטר של מדיה מלאה עבור תנאי שליטה וטיפול. על שתיים עד ארבע פרוסות מצופות על הכלים החדירים, להוסיף את המדיה מן aliquots טיפול בקרה ואת טיפולים משולבים נוספים שישמשו עבור המשך הזרם, ניתוח מת חי. השאירו פרוסות רקמה בתרבית המכילה DMEM מלא למשך יומיים עד חמישה ימים, החליפו מדיה כמו גם בורטזומיב ו-5-FU אחת ליומיים.
לניתוח כדאיות זוהרת, הוסיפו 500 מיקרוליטר PBS לצלחת של 12 בארות, והעבירו את פרוסות הרקמה המתאימות ברצף לתמיסת PBS באמצעות מברשת צבע או פיפטה של מיליליטר אחד. מוציאים את PBS מהפרוסות. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת הכדאיות הזוהרת לכל מצב ודגור עם סיבוב איטי על השייקר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני קריאת ההארה באמצעות קורא לוחות הארה.
הכתמת המוצין בפרוסות הרקמה הודגמה באמצעות צביעת שינוי חומצה תקופתית ונוגדנים ספציפיים למוצין. הדגירה בקלצין AM ובפרופידיום יודיד קבעה את הבריאות ואת הכדאיות. הגרעינים חפפו את התאים שהתרבו במהלך התרבית.
תוצאות אלה כומתו כדי לקבוע את מספר התאים המתרבים בתוך פרוסת הגידול. הפרוסות המודגרות בנוגדן מצומד CD11b PE וב- Fluo-4 AM, מסומנות בתאי החיסון המקומיים ב- CTU. תמונות בגודל פסאודו-צבע המציגות רמות סידן תוך-תאיות אפשרו להמחיש רמות דיפרנציאליות של סידן תוך תאי.
פעילות ספונטנית במעקב וזמן שחלף לפני, במהלך ואחרי תגובת סידן בין-תאית בתוך תא החיסון החיובי CD11b המודגש מוצג כאן. העקבות הגולמיים של תגובות סידן בתא החיסון CD11b, יחד עם תאים מגיבים אחרים שאינם מגיבים כומתו. תוצאות מייצגות של אימונוטיפ של מדגם גידול חולה עם pseudomyxoma peritonei מוצגים כאן.
כימות הפרופיל החיסוני של הגידול הראה כי בדגימת התורם 337 יש רמות גבוהות של מקרופאגים M2, דבר המצביע על כך ששימוש בפרוסות רקמה שמקורן בפסאודומיקסומה פריטוני איפשר לחקור את הנוף התאי הייחודי של התורם של דגימות הגידול של המטופל. פרמקוטיפ וניתוח במורד הזרם של פרוסות רקמות מרקמות אנושיות pseudomyxoma peritonei הראו את הריגת התאים בפרוסות הגידול כפי שאושר על ידי ניתוח ציטוטוקסיות והדמיית מנהרה קונפוקלית. בתגובה לתרופה ציטוטוקסית, bortezomib ו 5-fluorouracil.
ניתוח כדאיות זוהרת בוצע באמצעות פרוסות תואמות ברצף. ייצור מוצלח של פרוסות מגידולים מוציניים דורש דיסקציה קפדנית והסרה של רכיבי רקמה תאית ואצלולרית כמו שומן ורקמת דופן בטן צפופה. טכניקה זו יכולה לאפשר מידול אינטראקציות בין תאים סרטניים לבין סוגי תאים מרובים במיקרו-סביבה של הגידול, כגון אינטראקציות שומן, כלי דם ותאי חיסון.
