תרביות פרוסות אורגנוטיפיות כמודלים פרה-קליניים של מיקרו-סביבה גידולית בסרטן לבלב ראשוני וגרורות

פרוסות רקמה אורגנוטיפיות נוצרו מרקמות שונות. בשל שלמות הרקמה שהשתמרה ופיתוח טכניקות טיפוח, הם התאימו למידול מנגנונים פיזיולוגיים מורכבים. תרביות פרוסות אורגנוטיפיות מקרצינומה של הלבלב מחשבות מקרוב את הארכיטקטורה הרב-תאית של הגידול והמיקרו-סביבה שלו ex vivo.

הם יכולים לשמש עבור יישומים שונים במורד הזרם, כגון בדיקות תגובה לתרופות. ניתן לגדל אותם בתרבית מיד לאחר כריתה כירורגית של הגידול, והם זולים וגוזלים פחות זמן בהשוואה לרוב טכניקות התרבית הראשוניות האחרות. מי שתדגים את ההליך תהיה אולהה לפשינה, עוזרת טכנית מאוניברסיטת ליבק.

כדי להתחיל, להכין 100 מיליליטר של 8% agarose נמס נמוך על ידי המסת שמונה גרם של agarose ב 100 מיליליטר של תמיסת רינגר מחומם מראש, ולאחסן אותו על ארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. עם ההודעה על כריתת הגידול, ממיסים את האגרוז במיקרוגל. מניחים את האגרוז באמבט מים שחומם מראש, ומאפשרים לו להתקרר לטמפרטורות פיזיולוגיות לפני ההכנה.

הכניסו סכין גילוח למחזיק הוויברטומה ובצעו כוונון זווית אוטומטי בהתאם להוראות היצרן. מצננים את המעיל של תא החיתוך באמצעות יחידת קירור או קרח רטוב. מלאו את תא החיתוך בכ-100 מיליליטר של תמיסת רינגר, ולאחר מכן הכניסו את סכין הגילוח המותקן לתמיסת החיתוך המצוננת מראש, ואפשרו לסכין הגילוח להתקרר.

שטפו את דגימת הרקמה עם PBS מקורר והניחו אותה בצלוחית פטרי גדולה בקוטר 14 ס"מ על קרח. הסר רקמת חיבור עודפת נראית מקרוסקופית על קרח באמצעות אזמל. מניחים את הרקמה בצלחת פטרי קטנה.

התאימו את כיוון הרקמה, כך שרקמת החיבור המקרוסקופית הנותרת תהיה בעלת אותו כיוון כמו המישור של תחתית צלחת הפטרי. יוצקים את האגרוז מוכן נמס נמוך לתוך צלחת פטרי קטנה, להתאים מחדש את הכיוון של הרקמה. במידת הצורך, באמצעות מלקחיים, הניחו את צלחת הפטרי על קרח רטוב להתקשות מהירה יותר של האגרוז.

בזהירות לחתוך את הרקמה באמצעות אזמל, משאיר לפחות חמישה מ"מ של agarose שמסביב בכל צד של הרקמה. מוסיפים דבק למחזיק הדגימה, מורחים אותו, מעבירים את הרקמה המשובצת ומדביקים אותה על מחזיק הדגימה באמצעות דבק-על. לאחר מספר שניות, הכניסו את מחזיק הדגימה לתא החיתוך והתאימו את כיוון הרקמה לכיוון סכין הגילוח במידת הצורך.

הגדר את הגבולות החיצוניים של טווח החיתוך בהתאם לגודל דגימת הרקמה. כוונן את הלהב לכיוון החלק העליון של בלוק הרקמה. הגדר את מהירות החיתוך ל -0.04 מילימטר לשנייה, משרעת חיתוך למילימטר אחד ועובי פרוסה ל -300 מיקרומטר.

חותכים בזהירות את הפרוסות הראשונות ומעבירים את הפרוסות למיכל נפרד עם תמיסת רינגר מצוננת מראש על קרח רטוב. הכינו צלחת של שש בארות עם מיליליטר אחד של מדיום הטיפוח המתאים לכל באר. הכניסו את צלחת שש הבארות עם המדיום לאינקובטור, ואפשרו לטמפרטורה ול-pH להתאים את עצמם לפני הטיפוח.

הניחו את הפרוסות על תוספות תרבית תאים באמצעות מסנן מבט, ולאחר מכן הסירו את כל תמיסת הצלצול העודפת על ידי הנחת הפילטר הטעון על מטלית סטרילית. מניחים את הפילטר הטעון בצלחת שש בארות מוכנה מבלי להוסיף מדיום נוסף לאינסטרוקציה, ואז מניחים את צלחת שש הבארות באינקובטור ומחליפים את המדיום כל יומיים. מניחים את מסנן הטיפוח עם הפרוסה המותקנת על צלחת פטרי.

בעזרת אזמל, חותכים בזהירות את קרום המסנן עם פרוסת הרקמה המותקנת. מעבירים את קרום הפילטר עם הפרוסה המותקנת לשקית ניילון ביופסיה ומניחים אותה בקלטת הטבעה. לאחר מכן, מעבירים את קלטות ההטבעה מפלסטיק במיכל עם פורמלין 4.5% מקורר מראש למשך 24 שעות לפחות או עד לשימוש נוסף.

שטפו בזהירות את תרבית פרוסות הפורמלין במי ברז זורמים במשך שעה וחצי. לייבש את פרוסת הרקמה הקבועה פורמלין על ידי דגירה ב 70%95% אתנול מוחלט. לאחר מכן, נקה את פרוסת הרקמה הקבועה פורמלין עם שתי דגירות של שלוש שעות בקסילן.

לטבול את הרקמה עם פרפין ב 60 מעלות צלזיוס במשך הלילה ולאחר מכן שוב במשך שעתיים. הטמיעו את הרקמה בגוש פרפין בתבנית הטבעה של רקמה והניחו אותה על קרח כדי לקרר את הדגימה מהר יותר. חותכים את גוש הרקמה המשובץ בפרפין בעובי של ארבעה מיקרומטר עם מיקרוטום ובאמבט מים של 40 מעלות צלזיוס המכיל מים מזוקקים.

העבירו את המקטעים לשקופיות זכוכית. דוגרים על חלקי פרפין למשך שעה בחום של 60 מעלות צלזיוס כדי להצמיד את הרקמה לזכוכית. לאחר מכן, לדגור על המגלשות במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס.

deparaffinize חלקים על ידי דגירה ב xylene שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן, יש להחזיר נוזלים על ידי דגירות עוקבות באלכוהול מוחלט, 95% אלכוהול ו-70% אלכוהול. הכתימו את המקטעים בתמיסת מאייר המטוקסילין למשך חמש דקות ושטפו במי ברז זורמים במשך 10 דקות.

יש לכתם בתמיסת 0.5% ESN למשך 40 שניות ולשטוף במים מזוקקים, ולאחר מכן לחזור על התייבשות האתנול. נקה את הרקמה בשלושה שינויים של קסילן למשך מספר שניות כל אחד, ולאחר מכן הנח טיפה של אמצעי הרכבה וכסה את המגלשות בהחלקת כיסוי. המורפולוגיה המקרוסקופית של כל OTSC ירדה במהלך הטיפוח במשך שישה ימים.

הכדאיות נשמרת עבור OTSCs משני גידולים ראשוניים מייצגים בשני מדיות שונות הראתה ירידה בכדאיות לאחר יום אפס עקב הליך החתך והתאמה לתנאי התרבית, כמו גם עלייה בכדאיות של דגימת הגידול בפאנל הימני. חתכי כתמי H&E הראו כי המבנה הכולל של הרקמה נשמר לאורך כל תקופת הטיפוח ex vivo, וכי לא התגלו שינויים גסים של התפשטות ואפופטוזיס במהלך תקופת התרבית של שישה ימים. הערכה היסטופתולוגית מיקרוסקופית של קטעי H&E לא חשפה עלייה משמעותית בנמק של כל הרקמות המתורבתות במהלך הגידול.

הייתה עלייה בתאים חיוביים לקספאז-3 לאחר טיפוח אדנוקרצינומה ראשונית של צינור הלבלב, או PDAC, במשך 15 יום. ההיסטופתולוגיה של גרורות פריטוניאליות של PDAC הדגימה הטרוגניות תוך גידולית גבוהה בין פרוסות בודדות, כמו גם אפופטוזיס טבעי שנמדד על ידי צביעת קספאז-3 שסועה. צביעת H&E ואפיון אימונוהיסטולוגי של ציטוקרטין 7 בגרורות PDAC של דופן הבטן הראו כי ה- OTSCs הנגזרים לא הכילו תאי גידול כלשהם, אלא כללו רק רקמת חיבור, שהייתה חלקית נמקית.

כל פרוסה מתורבתת ניתנת לפרופיל בנפרד, בהתאם לשאלת המחקר הספציפית, לדוגמה, על ידי ריצוף RNA עבור שעתוק או הדמיה קלה עבור פרוטאומיקה מפוענחת מרחבית. בעתיד, לשילוב עם שיטות אנליטיות לא הרסניות יש פוטנציאל גדול לחיזוי תגובות ספציפיות למטופל למשטרים טיפוליים שונים.