이 방법을 사용하여 모니터링되는 뉴런의 수는 이전 방법이나 다른 방법을 사용하여 불가능한 뉴런 네트워크 데이터를 수집할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 뒷발에 가해지는 자극에 직접 반응하여 한 번에 거의 2, 000 개의 1 차 감각 뉴런을 모니터링 할 수 있다는 것입니다. 이 절차는 말초 이질통 및 통증 과민증에 대한 치료 중재를 연구하는 데 특히 적합합니다.
이 방법은 삼차 신경절 또는 슬상 신경절 연구에 적용하거나 순환 AMP와 같은 전압 또는 세포 신호 분자에 대해 유전적으로 인코딩된 센서와 함께 사용할 수 있습니다. 이 수술을 수행하려면 연습이 필요합니다. 한 마리의 동물에 대해 최대 6개의 등쪽 뿌리 신경절에서 연습할 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 John Shannonhouse와 Mr.Ruben Gomez의 도움을 받아 제가 할 것입니다. 시작하려면 체온을 섭씨 37도로 유지하기 위해 가열된 패드에 마우스를 놓습니다. 마우스의 골반 뼈를 느껴 요추 확대를 찾습니다.
그런 다음 요추 확대 부위 위로 마우스 뒤쪽을 면도하십시오. 가위를 사용하여 요추 확대 부위 위에 3면 직사각형 절개를하고 집게로 피부를 접습니다. 13mm 스프링 해부 가위를 사용하여 척추 오른쪽에 3-4mm 절개를 합니다.
가위를 사용하여 피부와 근육을 옆으로 잘라 척추를 노출시킵니다. 그런 다음 8mm 가위를 사용하여 근육과 결합 조직을 잘라내어 오른쪽 L5 DRG의 횡돌기를 청소합니다. 면봉이나 Gelfoam을 사용하여 혈액을 흡수하여 출혈을 최소화하십시오.
DRG를 만지지 않도록 주의하면서 Friedman-Pearson rongeurs 또는 강한 미세 집게를 사용하여 오른쪽 L5 횡단 프로세스를 잘라냅니다. 그런 다음 마우스와 가열 패드를 사용자 지정 단계로 이동합니다.tage. 사용 stage, 테이프를 사용하여 동물과 가열 패드를 제자리에 고정합니다.
지속적인 이소 플루 란 마취를 위해 동물의 코를 코 콘에 놓습니다. 자극을 쉽게 적용할 수 있도록 오른쪽 뒷발을 무대에서 튀어나온 위치에 고정합니다. 스테이지 클램프로 척추를 제자리에 고정합니다.amp척추 또는 골반 뼈의 피부 위에 L5 DRG의 주둥이와 꼬리만 있습니다.
클램프와 스테이지를 조정하여 DRG의 표면을 가능한 한 평평하게 만듭니다. 그런 다음 스테이지를 현미경 아래에 놓아 대물렌즈를 낮췄을 때 대물렌즈가 DRG보다 바로 위에 8mm 위에 오도록 합니다. 직장 체온계를 삽입합니다.
전원선을 가열 패드와 직장 체온계에 연결합니다. 노즈 콘을 이소플루란 가스 라인에 연결합니다. 10x 0.4 DIC 대물렌즈가 있는 정립 컨포칼 현미경과 이미징을 위한 관련 소프트웨어를 사용합니다.
495 나노미터에서의 여기, 519 나노미터에서의 방출, 500에서 580 나노미터 사이의 검출 파장의 녹색 FITC 필터 설정을 사용합니다. 현미경으로 DRG의 표면을 찾으십시오. 클램프 조정tages는 DRG 표면이 가능한 한 수평이 되고 최대 표면적이 초점면에서 시각화되도록 합니다.
과다 복용없이 이소 플루 란 마취를 유지하기 위해 절차 전반에 걸쳐 동물을 모니터링하십시오. 현미경 고속 스캐닝 프로토콜을로드하려면 복셀 크기 2.496 x 2.496 x 16 미크론, 512 x 512 픽셀, 10 광학 슬라이스 Z 스택, 32 마이크로 미터의 Airy 장치 1 개, 488 나노 미터 및 5 밀리 와트의 1 % 레이저 출력, 픽셀 시간 1.52 마이크로 초, 라인 시간 0.91 밀리 초, 프레임 시간 465 밀리 초, LSM 스캔 속도 8, 양방향 스캐닝, PMT 검출기 이득 650V 및 디지털 이득 1. 획득(Acquisition) 탭에서 실험 시작(Start Experiment)을 클릭하여 DRG를 8주기로 짧게 스캔합니다.
시간이 지남에 따라 프레임당 한 번의 스캔으로 스캔의 직교 투영을 만들어 동영상을 만듭니다. 이미지 선명도 및 이미징 아티팩트(예: DRG를 가로지르는 밝기 파동)를 수동으로 확인합니다. 클램프 위치와 광학 단면 두께를 조정하고 선명한 고품질 동영상이 나올 때까지 이 단계를 반복합니다.
그런 다음 복셀 크기 1.248 x 1.248 x 14 미크론, 1024 x 1024 픽셀, 6 개의 광학 슬라이스 Z 스택, 1.2 Airy 단위 또는 39 마이크로 미터, 488 나노 미터 및 25 밀리 와트의 5 % 레이저 출력, 픽셀 시간 2.06 마이크로 초, 라인 타임 4.95 밀리 초, 프레임 시간 5.06 초, LSM 스캔 속도 6, 양방향 스캐닝, 650V에서 PMT 검출기 이득 및 1의 디지털 이득. 획득 탭 아래의 실험 시작 버튼을 클릭하여 DRG의 고해상도 이미지를 만듭니다. 현미경 신속 스캐닝 프로토콜을 로드하고 80주기 동안 DRG에서 자발적인 활동을 기록합니다.
직교 프로젝션 동영상을 생성하고 이미지 품질이 분석에 충분한지 확인합니다. 자극을 가하려면 현미경을 15-20회 스캔하도록 설정하십시오. 기준선을 생성하기 위해 1-5 스캔이 완료될 때까지 기다립니다.
스캔 6에서 10까지 자극을 가하십시오. 둔감화를 방지하기 위해 다음 자극을 적용하기 전에 각 자극 후 최소 5분을 기다리십시오. 기계식 프레스의 경우 발을 건드리지 않고 패들 사이에 발로 알고미터의 집게를 잡습니다.
스캔 5가 끝난 직후부터 시작하여 스캔 10 직후에 멈추는 발을 꼬집습니다. 알고미터로 가압력을 모니터링하고 원하는 힘보다 10g을 초과하지 않는지 확인하십시오. 열 자극을 위해 물 비커를 원하는 온도 바로 위로 가열하십시오.
물이 올바른 온도에있을 때, 발을 물에 담그면 스캔 5 직후에 자극을 가하십시오. 스캔 10 직후 비커를 당겨 빼냅니다. 외과 적 L5 DRG 노출 후 공초점 현미경을 통해 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 한 번에 최대 1, 800 개의 뉴런을 이미지화 할 수있었습니다.
일차 감각 뉴런은 자극이 없고 정상적인 생리학적 맥락에서 자극에 대한 반응으로 자발적인 칼슘 일시적인 현상에 대한 인구 수준의 앙상블에서 관찰되었습니다. 강한 자극이나 유독한 열은 칼슘 반응을 증가시켰습니다. 100g으로 압착하는 것과 비교하여 300g으로 압착하면 칼슘 과도 현상을 생성하는 뉴런의 수와 곡선 아래의 F0 면적만큼 델타 F가 증가했습니다.
섭씨 21도에서 45도의 무해한 온도 범위에서 따뜻한 열은 칼슘 과도 현상을 생성하는 뉴런의 수와 곡선 아래의 F0 면적만큼 델타 F를 증가시켰습니다. 무해한 온도는 섭씨 57도에서 유해한 열 자극에 비해 일시적인 현상을 생성하는 더 적은 수의 뉴런을 활성화했습니다. 또한, 더 작은 직경과 중간 직경의 뉴런은 모든 자극 하에서 자발적으로 일시적인 칼슘을 생성했지만, 더 큰 직경의 뉴런은 300g의 프레스 자극에 반응하여 일시적인 칼슘만 생성했습니다.
DRG는 수평이어야 하며 최적의 광학 슬라이스 두께여야 합니다. 최대 셀 수를 감지할 수 있고 동영상에 물결 모양이 없어야 합니다. 이 기술은 체성 감각 및 미각에 대한 인구 수준에서 감각 양식을 분석하고 만성 및 신경병성 통증에 기여하는 쌍 또는 동기화된 클러스터에서 활성화되는 인접 뉴런을 연구하는 데 사용되었습니다.
