Bu yöntem kullanılarak izlenen nöronların sayısı, eski veya diğer yöntemlerin kullanılmasının imkansız olacağı nöron ağı verilerinin toplanmasına izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, arka pençeye uygulanan uyaranlara doğrudan yanıt veren, aynı anda yaklaşık 2.000 birincil duyusal nöronu izleme yeteneğidir. Bu prosedür özellikle periferik allodini ve ağrı aşırı duyarlılığı için terapötik müdahaleleri incelemek için çok uygundur.
Bu yöntem, trigeminal veya genikülat ganglionları incelemek için uyarlanabilir veya siklik AMP gibi voltaj veya hücre sinyal molekülleri için genetik olarak kodlanmış sensörlerle kullanılabilir. Bu ameliyatı gerçekleştirmek pratik gerektirir. Tek bir hayvan üzerinde altı adede kadar sırt kökü gangliyonu üzerinde pratik yapabilirsiniz.
John Shannonhouse ve Bay Ruben Gomez'in yardımıyla prosedürü kendim göstereceğim. Başlamak için, vücut ısısını 37 santigrat derecede tutmak için fareyi ısıtılmış bir pedin üzerine yerleştirin. Farenin pelvik kemiğini hissederek bel genişlemesini bulun.
Ardından, farenin arkasını bel büyütme alanının üzerinde tıraş edin. Makas kullanarak, bel genişlemesinin üzerinde üç taraflı dikdörtgen bir kesi yapın ve cildi forsepslerle katlayın. Omurganın sağ tarafında üç ila dört milimetrelik kesikler yapmak için 13 milimetrelik yaylı diseksiyon makasını kullanın.
Omurgayı açığa çıkarmak için cildi ve kasları yanlara doğru kesmek için makas kullanın. Daha sonra, sekiz milimetrelik makas kullanarak, sağ taraf L5 DRG'nin enine işlemini temizlemek için kas ve bağ dokusunu kesin. Kanı emmek için pamuk veya Jelfoam kullanarak kanamayı en aza indirmeye çalışın.
DRG'ye dokunmamaya dikkat ederek Friedman-Pearson rongeurs veya güçlü ince forsepsler kullanarak sağ taraftaki L5 enine işlemini kesin. Ardından, fareyi ve ısıtma yastığını özel sahne alanına getirin. Hayvanı ve ısıtma yastığını yerine sabitlemek için sahne bandı kullanın.
Sürekli izofluran anestezisi için hayvanın burnunu burun konisine yerleştirin. Uyaranların kolay uygulanması için sağ arka pençeyi sahneden uzak bir konuma yapıştırarak sabitleyin. Omurgayı, omurlardaki cildin üzerindeki sahne kelepçeleri veya pelvik kemiğin L5 DRG'ye sadece rostral ve kaudal olarak yerine sabitleyin.
DRG'nin yüzeyini mümkün olduğunca düz hale getirmek için kelepçeleri ve sahneyi ayarlayın. Ardından, aşamayı mikroskopun altına yerleştirin, böylece hedef indirildiğinde DRG'nin doğrudan sekiz milimetre üzerinde olur. Rektal termometreyi takın.
Güç hatlarını ısıtma yastığına ve rektal termometreye bağlayın. Burun konisini izofluran gaz hatlarına bağlayın. 10x 0.4 DIC hedefine ve görüntüleme için ilgili yazılıma sahip dik bir konfokal mikroskop kullanın.
495 nanometrede uyarma, 519 nanometrede emisyon ve 500 ila 580 nanometre arasında algılama dalga boyunun yeşil FITC filtre ayarlarını kullanın. Mikroskop altında, DRG'nin yüzeyini bulun. Sahne alanındaki kelepçeleri, DRG yüzeyi mümkün olduğunca düz olacak ve maksimum yüzey alanı odak düzleminde görselleştirilecek şekilde ayarlayın.
Aşırı doz almadan izofluran anestezisini korumak için prosedürü boyunca hayvanı izleyin. Mikroskop hızlı tarama protokolünü yüklemek için, voksel boyutu 2.496 x 2.496 x 16 mikron, 512 x 512 piksel, 10 optik dilim Z-yığını, 32 mikrometre için bir Airy ünitesi, 488 nanometre ve beş miliwatt'ın% 1'lik lazer gücü, piksel süresi 1.52 mikrosaniye, çizgi süresi 0.91 milisaniye, kare süresi 465 milisaniye, LSM tarama hızı sekiz, çift yönlü tarama, PMT dedektörü 650 volt kazanç ve bir dijital kazanç. Edinme sekmesinin altındaki Denemeyi Başlat'ı tıklayarak DRG'nin kısa, sekiz döngülü bir taramasını yapın.
Zaman içinde kare başına bir taramada taramaların ortogonal projeksiyonunu yaparak bir film oluşturun. DRG'yi geçen parlaklık dalgaları gibi görüntü netliği ve görüntüleme yapıtlarını manuel olarak kontrol edin. Kelepçe konumunu ve optik bölüm kalınlığını ayarlayın ve net, yüksek kaliteli bir film elde edilene kadar bu adımı tekrarlayın.
Ardından, voksel boyutu 1.248 x 1.248 x 14 mikron, 1024 x 1024 piksel, altı optik dilim Z-yığını, 1.2 Airy birimi veya 39 mikrometre, 488 nanometre ve 25 miliwatt'ın% 5 lazer gücü, piksel süresi 2.06 mikrosaniye, satır süresi 4.95 milisaniye, kare süresi 5.06 saniye, altı LSM tarama hızı, çift yönlü tarama, 650 voltta PMT dedektörü kazancı ve bir dijital kazanç. DRG'nin yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü oluşturmak için Edinme sekmesinin altındaki Denemeyi Başlat düğmesine tıklayın. Mikroskop hızlı tarama protokolünü yükleyin ve 80 döngü boyunca DRG'de spontan aktiviteyi kaydedin.
Ortogonal bir projeksiyon filmi oluşturun ve görüntünün analiz için yeterli kalitede olduğunu doğrulayın. Uyaranları uygulamak için, mikroskobu 15 ila 20 tarama yapacak şekilde ayarlayın. Taban çizgisini oluşturmak için bir ila beş arasındaki taramaların tamamlanmasını bekleyin.
Altı ila 10 arasındaki taramalar sırasında uyaranı uygulayın. Duyarsızlaşmayı önlemek için bir sonrakini uygulamadan önce her uyaranı takiben en az beş dakika bekleyin. Mekanik bir pres için, algometrenin kıskaçını, pençeye dokunmadan kürekler arasındaki pençe ile tutun.
Beş taramanın bitiminden hemen sonra başlayan ve tarama 10'dan hemen sonra duran pençeyi sıkıştırın. Pres kuvvetini bir algometre ile izleyin ve istenen kuvvetin üzerinde 10 g'ı geçmediğinden emin olun. Termal uyaranlar için, bir su kabını istenen sıcaklığın hemen üzerine ısıtın.
Su doğru sıcaklıkta olduğunda, pençeyi suya batırarak beş taramadan hemen sonra uyaranı uygulayın. 10 taramasından hemen sonra beheri çekin. Cerrahi L5 DRG maruziyeti ve ardından konfokal mikroskopi, Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak aynı anda 1.800 nörona kadar görüntülenmesine izin verdi.
Primer duyusal nöronlar, uyaranların yokluğunda ve normal fizyolojik bağlamlarında uyaranlara yanıt olarak spontan kalsiyum geçicileri için popülasyonel düzeyde bir toplulukta gözlenmiştir. Güçlü uyaranlar veya zararlı ısı, kalsiyum tepkilerini arttırdı. 100 g ile preslemeye kıyasla, 300 g ile presleme, kalsiyum geçici maddeleri üreten nöronların sayısını ve eğrinin altındaki delta F'yi F0 alanı ile arttırdı.
21 ve 45 santigrat derecelik zararlı olmayan bir sıcaklık aralığındaki ılık ısı, kalsiyum geçici maddeleri üreten nöronların sayısını ve eğrinin altındaki delta F'yi F0 alanına kadar arttırdı. Zararlı olmayan sıcaklıklar, 57 santigrat derecedeki zararlı bir ısı uyaranına kıyasla geçici olarak üreten daha az sayıda nöronu aktive etti. Ayrıca, daha küçük ve orta çaplı nöronlar kendiliğinden ve tüm uyaranlar altında geçici kalsiyum ürettiler, ancak daha büyük çaplı nöronlar sadece 300 g pres uyaranına yanıt olarak kalsiyum geçici ürettiler.
DRG düz ve optimum optik dilim kalınlığında olmalıdır. Maksimum hücre sayısını tespit edebileceğiniz ve filmde dalgalılık olmayacak şekilde olmalıdır. Bu teknik, somatosensitasyon ve tat için popülasyonel düzeyde duyusal modaliteleri analiz etmek ve kronik ve nöropatik ağrıya katkıda bulunan çiftler halinde veya senkronize kümelerde aktive olan bitişik nöronları incelemek için kullanılmıştır.
