O número de neurônios monitorados usando este método permite a coleta de dados da rede de neurônios que seriam impossíveis usando métodos mais antigos ou outros. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de monitorar quase 2.000 neurônios sensoriais primários de uma só vez, respondendo diretamente aos estímulos aplicados à pata traseira. Este procedimento é especialmente adequado para estudar intervenções terapêuticas para alodínia periférica e hipersensibilidade à dor.
Este método pode ser adaptado para o estudo de gânglios trigeminais ou geniculados ou usado com sensores codificados geneticamente para moléculas de voltagem ou sinalização celular, como o AMP cíclico. É preciso prática para realizar essa cirurgia. Você pode praticar em até seis gânglios da raiz dorsal em um único animal.
Quem demonstrará o procedimento será eu, com a ajuda de John Shannonhouse e do Sr. Ruben Gomez. Para começar, coloque o mouse em uma almofada aquecida para manter a temperatura corporal em 37 graus Celsius. Localize o aumento lombar sentindo o osso pélvico do rato.
Em seguida, raspe a parte de trás do mouse acima da área de alargamento lombar. Usando tesoura, faça uma incisão retangular de três lados acima do aumento lombar e dobre a pele com pinças. Use a tesoura de dissecção de mola de 13 milímetros para fazer incisões de três a quatro milímetros no lado direito da coluna.
Use tesoura para cortar a pele e os músculos para os lados para expor a coluna. Em seguida, usando tesoura de oito milímetros, corte o músculo e o tecido conjuntivo para limpar o processo transverso do lado direito L5 DRG. Tente minimizar o sangramento usando algodão ou Gelfoam para absorver o sangue.
Abra o processo transversal L5 do lado direito usando rongeurs de Friedman-Pearson ou pinças finas fortes, tomando cuidado para não tocar no DRG. Em seguida, mova o mouse e a almofada de aquecimento para o palco personalizado. Use fita adesiva para prender o animal e a almofada de aquecimento no lugar.
Colocar o nariz do animal no cone nasal para anestesia contínua com isoflurano. Fixe a pata traseira direita em uma posição fora do palco para facilitar a aplicação dos estímulos. Fixe a coluna no lugar com as pinças de estágio sobre a pele nas vértebras ou o osso pélvico apenas rostral e caudal ao DRG L5.
Ajuste as braçadeiras e o palco para tornar a superfície do DRG o mais nivelada possível. Em seguida, coloque o estágio abaixo do microscópio para que a objetiva fique diretamente oito milímetros acima do DRG quando abaixada. Insira o termômetro retal.
Conecte as linhas de energia à almofada de aquecimento e ao termômetro retal. Conecte o cone nasal às linhas de gás isoflurano. Use um microscópio confocal vertical com objetiva DIC 10x 0,4 e o software associado para aquisição de imagens.
Use as configurações do filtro FITC verde de excitação a 495 nanômetros, emissão a 519 nanômetros e comprimento de onda de detecção entre 500 e 580 nanômetros. Sob o microscópio, encontre a superfície do DRG. Ajuste as braçadeiras no palco para que a superfície DRG fique o mais nivelada possível e a área de superfície máxima seja visualizada no plano focal.
Monitorar o animal durante todo o procedimento para manter a anestesia com isoflurano sem sobredosagem. Para carregar o protocolo de varredura rápida do microscópio, use as configurações típicas de tamanho de voxel 2.496 por 2.496 por 16 mícrons, 512 por 512 pixels, 10 fatias ópticas Z-stack, uma unidade Airy para 32 micrômetros, 1% de potência laser de 488 nanômetros e cinco miliwatts, tempo de pixel 1,52 microssegundos, tempo de linha 0,91 milissegundos, tempo de quadro 465 milissegundos, velocidade de varredura LSM de oito, varredura bidirecional, detector de PMT ganho de 650 volts, e ganho digital de um. Faça uma varredura curta de oito ciclos do DRG clicando em Iniciar experimento na guia Aquisição.
Crie um filme fazendo uma projeção ortogonal de varreduras em uma varredura por quadro ao longo do tempo. Verifique manualmente a clareza da imagem e os artefatos de imagem, como ondas de brilho cruzando o DRG. Ajuste a posição da braçadeira e a espessura da seção óptica e repita essa etapa até obter uma película clara e de alta qualidade.
Em seguida, carregue o protocolo de varredura de alta resolução do microscópio usando as configurações típicas de tamanho de voxel 1,248 por 1,248 por 14 mícrons, 1024 por 1024 pixels, seis fatias ópticas Z-stack, unidade 1,2 Airy ou 39 micrômetros, 5% de potência do laser de 488 nanômetros e 25 miliwatts, tempo de pixel 2,06 microssegundos, tempo de linha 4,95 milissegundos, tempo de quadro 5,06 segundos, velocidade de varredura LSM de seis, varredura bidirecional, ganho do detector de PMT a 650 volts e ganho digital de um. Clique no botão Iniciar experimento na guia Aquisição para criar uma imagem de alta resolução do DRG. Carregue o protocolo de varredura rápida do microscópio e registre a atividade espontânea no DRG por 80 ciclos.
Gere um filme de projeção ortogonal e verifique se a imagem é de qualidade suficiente para análise. Para aplicação de estímulos, ajuste o microscópio para realizar de 15 a 20 varreduras. Aguarde a conclusão das varreduras de um a cinco para produzir a linha de base.
Aplicar o estímulo durante os exames de seis a 10. Aguarde pelo menos cinco minutos após cada estímulo antes de aplicar o próximo para evitar dessensibilização. Para uma prensa mecânica, segure a pinça do algômetro com a pata entre as pás sem tocar a pata.
Aperte a pata começando imediatamente após o final da varredura cinco e parando imediatamente após a varredura 10. Monitore a força de pressão com um algômetro e certifique-se de que ela não exceda 10 g acima da força desejada. Para estímulos térmicos, aqueça um copo de água até um pouco acima da temperatura desejada.
Quando a água estiver na temperatura correta, aplique o estímulo imediatamente após a varredura cinco, mergulhando a pata na água. Puxe o copo imediatamente após a varredura 10. A exposição cirúrgica ao DRG L5 seguida de microscopia confocal permitiu que até 1.800 neurônios fossem imageados de uma só vez usando camundongos Pirt-GCaMP3.
Neurônios sensoriais primários foram observados em um conjunto em nível populacional para transitórios espontâneos de cálcio na ausência de estímulos e em resposta a estímulos em seu contexto fisiológico normal. Estímulos fortes ou calor nocivo aumentaram as respostas de cálcio. Em comparação com a prensagem com 100 g, a prensagem com 300 g aumentou o número de neurônios produtores de transientes de cálcio e a área delta F por F0 sob a curva.
O calor quente em uma faixa de temperatura não nociva de 21 e 45 graus Celsius aumentou o número de neurônios produzindo transientes de cálcio e a área delta F por F0 sob a curva. Temperaturas não nocivas ativaram um número menor de neurônios produzindo transientes em comparação com um estímulo térmico nocivo a 57 graus Celsius. Além disso, neurônios de diâmetro menor e médio produziram transientes de cálcio espontaneamente e sob todos os estímulos, mas neurônios de maior diâmetro só produziram transientes de cálcio em resposta ao estímulo de pressão de 300 g.
O DRG deve ser nivelado e de espessura de corte óptico ideal. Deve ser tal que você possa detectar o número máximo de células e não há oscilação no filme. Esta técnica tem sido utilizada para analisar modalidades sensoriais em nível populacional para somatosensação e paladar e para estudar neurônios adjacentes ativados em pares ou em agrupamentos sincronizados que contribuem para a dor crônica e neuropática.
