פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שלתאים שליליים לין ותאי SK שבודדו מאותם עכברים תורמים לא היה הבדל נראה לעין ביצירת AML המושרה על ידי MLL-AF9. כמו כן, הזרקת IP של תאים לוקמיים יכולה לפתח בהצלחה מודל עכבר של AML. בהשוואה לשיטות השתלה קונבנציונליות, טכניקה זו נוחה יותר וזולה יותר.
כדי להתחיל, לעקר את העכבר CD45.1 נקבה C57BL/6J בן 8 עד 10 שבועות עם 70% אתנול. הניחו את העכבר על כרית ניתוחים סטרילית על לוח קלקר ונעצו את הרגליים דרך כריות כפות העכבר. חותכים את העור מעל חלל הבטן בקו האמצע ומרחיבים את החלל התת עורי לכיוון הרגליים האחוריות בעזרת מספריים סטריליים חדים.
האריכו את החתך מקו האמצע של הבטן עד לקרסוליים והרחיבו את החלל התת עורי מתחת לרגליים האחוריות בעזרת להבי מספריים חדים. חותכים את גיד אכילס עם מספריים חדים. החזיקו את הגיד באמצעות מלקחיים עם שיניים וחתכו את הקצה השני המחובר לעצם הירך כדי להסיר את שריר הגסטרוקנמיוס.
חותכים את גיד הארבע ראשי המחובר לברך בעזרת מספריים חדים. החזיקו את הגיד וחתכו את ראש השריר המחובר לעצם הירך כדי להסיר את שריר הגסטרוקנמיוס. חותכים את השרירים האחרים המקיפים את עצם הירך בקצה המחובר לשוקה.
לאחר מכן, לחתוך את הקרסול עם מספריים חדים, להבטיח כי השוקה נשאר שלם. החזיקו את הקצה הדיסטלי של עצם הירך וחתכו את מפרק הירך במספריים חדים, כדי להבטיח שראש עצם הירך יישאר שלם. מעבירים את עצם העצם ואת עצם הירך לחיץ זרימה בצינור של 15 מיליליטר.
להפריד את השוקה ואת עצם הירך על ידי שבירת הברך ביד. הסר את הפטלה, הסחוס וקונדיל הירך כדי לחשוף את הרמה הטיביאלית ואת עצם הירך הדיסטלית. הסר את השרירים באמצעות גזה סטרילית והשרה את העצמות בחיץ זרימה.
חותכים את צוואר הירך ושוטפים את תאי מח העצם עם חיץ זרימה משני קצוות עצם הירך באמצעות מזרק 10 מיליליטר עם מחט 23 מד. לאחר מכן, לחתוך את malleolus tibial ולשטוף את תאי מח העצם עם חיץ זרימה משני הקצוות של השוקה. לפזר את התאים על ידי pipeting למעלה ולמטה באמצעות מזרק 10 מיליליטר עם מחט 18 מד.
צנטריפוגו את המתלה החד-תאי בארבע מעלות צלזיוס וב-400 גרם למשך שלוש דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של תאי דם אדומים, או RBC, חיץ ליזיס כדי לשכב את RBCs למשך שלוש דקות. הוסף חמישה מיליליטר של חיץ זרימה כדי לעצור את הליזה.
לאחר מכן צנטריפוגו את מתלה התא והשהו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של חיץ זרימה. מניחים מסננת תאים של 70 מיקרון על צינור של 50 מיליליטר ומעבירים את המתלה דרך המסננת כדי לאסוף את התאים. כוונן את ריכוז התא עם חיץ זרימה לאחת פעמים 10 לשמונה למיליליטר בצינורות פוליפרופילן תחתונים עגולים.
בחר תאים שליליים לשושלת באמצעות ערכת בידוד תאים המטופויטיים של עכבר בהתאם להוראות היצרן. לאחר שסיימתם, צנטריפוגו את תאי הגזע ההמטופויטיים הממוינים ואת התאים השליליים של השושלת הלא ממוינת והשהו מחדש בשלושה מיליליטר של פי 2 ציטוקינים, מדיה IMDM, ושלושה מיליליטר של סופרנאטנט ויראלי בצלחת מצופה רטרו-רדוקציה. לדגור על המנה באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 או 24 שעות.
לאחר הטרנסדוקציה, קצרו את התאים בצנטריפוגה. במידת הצורך, השתמש טריפסין כדי לאסוף את התאים המחוברים לתחתית הצלחת. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-PBS שחומם מראש.
הזריקו תאים לעכבר המושתל הראשי רטרו-אורביטלית או תוך צפקית עם חצי מחט של 27 מד. נטר את העכבר מדי יום. לאחר חודש, לאסוף דם מדי שבוע על ידי דימום רטרו-אורביטלי כדי לפקח על לויקוציטוזה על ידי הערכת ספירת הדם המלאה על HEMAVET.
Proptose את העין עם האגודל ואת האצבע המורה, ולאחר מכן לחדור את מקלעת הסינוס ורידי עם צינור נימי hematocrit סטרילי דרך canthus הפנימי. לאסוף 20 עד 25 מיקרוליטר של דם לתוך צינור איסוף דם EDTA ולסגור את העפעפיים כדי לעצור את הדימום. החל טיפה אחת של תמיסה אופתלמית ג gentamycin סולפט על העין.
כאשר תאי הדם הלבנים מגיעים ארבע פעמים 10 לארבעת התאים למיקרוליטר, בודדו את תאי מח העצם על ידי שטיפת עצם הירך והטיביאס עם חיץ זרימה, ואחריו ליזה RBC כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, כדי לקצור את הטחול, הניחו את העכבר על כרית כירורגית סטרילית על לוח קלקר ונעצו את הרגליים דרך כריות כפות העכבר. לעקר את העכבר עם 70% אתנול.
חותכים את העור והשריר בקו האמצע כדי לחשוף את חלל הבטן עם מספריים סטריליים חדים. בודדו את הטחול והכניסו אותו למאגר זרימה בצינור של 15 מיליליטר. ערבבו את הטחול דרך מסננת של 70 מיקרון בצלחת של שישה סנטימטרים עם שלושה מיליליטר של חיץ זרימה.
מעבירים את התאים מהצלחת לצינור של 15 מיליליטר, ואז צנטריפוגו את המתלה החד-תאי, משליכים את הסופרנטנט ומשעיפים מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של חיץ ליזיס RBC למשך שלוש דקות. הוסף חמישה מיליליטר של חיץ זרימה כדי לעצור את הליזיס וצנטריפוגה את מתלה התא. השהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של חיץ זרימה, ערבב ועבור דרך מסננת תאים של 70 מיקרון כדי לאסוף תאים לתוך צינור 50 מיליליטר.
זיהוי תאי לוקמיה מיאלואידית חריפה ראשונית, או AML, על ידי צביעת הטחול ותאי מח העצם עם נוגדן CD45.1 מצומד נגד עכבר FITC וזיהוי על ציטומטר זרימה. התאים מגודרים תחילה על FSC-A, FSC-H ו- FSC-A, SSC-A, כדי לרכוש סינגלטים. האוכלוסייה החיובית CD45.1 מגודרת על חלקת FL1 על ידי השוואתה לתאים לא מוכתמים.
להשתלה שניונית, השהה מחדש תאים ספלניים CD45.1 AML ממושתלים רטרו-אורביטליים ראשוניים ב- PBS והזריק אותם רטרו-אורביטלית לעכבר זכר CD45.2. נוכחות של לויקוציטוזה חריגה וחדירה מוגברת של תאים לוקמיים במח העצם ובטחול תומכת בהיתכנות של שימוש בתאים שליליים לשושלת מח העצם ליצירת AML ראשוני. לא נצפו הבדלים משמעותיים בנמענים ראשוניים שתורגמו עם LSK או תאים שליליים לשושלת.
תאי AML התפשטו בחלל הבטן של מושתלים ראשוניים על ידי לוקמיה מעורבת של שושלת או תאים שליליים לשושלת MLL-AF9. תוצאות אלה גם אישרו את הקמתו של AML ראשוני באמצעות הזרקה תוך צפקית של תאים שליליים לשושלת מח עצם MLL-AF9 בצורה של לויקוציטוזה ונוכחות של תאי AML במח העצם ובטחול של עכברים מושתלים. עם זאת, השתלה ראשונית באמצעות הזרקה תוך צפקית לקחה זמן רב יותר לפתח AML מאשר באמצעות הזרקה רטרו-אורביטלית למרות מספר זהה של תאי תורם.
המושתלים המשניים הראו לויקוציטוזה והפטוספלנומגליה משמעותית תוך פחות מחודש לאחר ההשתלה. תאי AML התגלו גם בדם ההיקפי, במח העצם ובטחול, כמו גם בחלל הצפק. הזרקה תוך-צפקית של שמונה פעמים 10 לחמשת תאי AML השיגה קליטה דומה להזרקה רטרו-אורביטלית של שמונה פעמים 10 לחמש AML.
העכברים המושתלים השלישוניים הציגו סימני AML חריפים כולל לויקוציטוזה והפטוספלנומגליה, נוכחות תאים לוקמיים בדם, מח העצם והטחול, תצפית היסטולוגית של עצם הירך והטחול הדגימה עוד יותר את חדירת התאים הלוקמיים. בהשוואה להשתלות השניוניות והשלישוניות, ההשתלה השלישונית התקדמה הרבה יותר מהר מההשתלה השניונית. עבור המודל הנוכחי, מיון תאי LSK הוא מיותר.
תאים שליליים לין יכול להיות מומר עם וירוס AML במשך 6 שעות או 24 שעות. זה לא ישפיע על היעילות של הקמת המודל.
