Bu protokol önemlidir, çünkü aynı donör farelerden izole edilen lin-negatif hücreler ve SK hücreleri, MLL-AF9 ile indüklenen AML oluşumunda belirgin bir fark göstermemiştir. Ayrıca, lösemik hücrelerin IP enjeksiyonu, AML'nin bir fare modelini başarıyla geliştirebilir. Geleneksel transplantasyon yöntemlerine kıyasla, bu teknik daha uygun ve daha ucuzdur.
Başlamak için, 8 ila 10 haftalık CD45.1 dişi C57BL/6J fareyi %70 etanol ile sterilize edin. Fareyi strafor bir tahta üzerindeki steril bir cerrahi pedin üzerine yerleştirin ve bacakları fare pençesi pedlerinden geçirin. Cildi orta hatta karın boşluğunun üzerinde kesin ve deri altı boşluğunu keskin uçlu steril makasla arka bacaklara doğru genişletin.
Kesi karın orta hattından ayak bileklerine kadar uzatın ve keskin uçlu makas bıçaklarıyla arka bacakların altındaki deri altı boşluğunu genişletin. Aşil tendonunu keskin uçlu makasla kesin. Tendonu dişlerle forseps kullanarak tutun ve gastroknemius kasını çıkarmak için femura bağlı diğer ucu kesin.
Diz üzerine tutturulmuş kuadriseps tendonunu keskin uçlu makasla kesin. Tendonu tutun ve gastroknemius kasını çıkarmak için femura bağlı kas kafasını kesin. Tibiaya bağlı sonunda femuru çevreleyen diğer kasları kesin.
Daha sonra, ayak bileğini keskin uçlu makasla kesin ve tibianın bozulmadan kalmasını sağlayın. Femurun distal ucunu tutun ve kalça eklemini keskin uçlu makasla kesin, femur başının sağlam kalmasını sağlayın. Tibias ve femurları 15 mililitrelik bir tüpteki bir akış tamponuna aktarın.
Tibia ve femuru diz elle kırarak ayırın. Tibial plato ve distal femuru ortaya çıkarmak için patella, kıkırdak ve femoral kondilleri çıkarın. Steril gazlı bez kullanarak kasları çıkarın ve kemikleri bir akış tamponuna batırın.
Femur boynunu kesin ve kemik iliği hücrelerini, 23 gauge iğneli 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak femurun her iki ucundan akış tamponu ile yıkayın. Daha sonra, tibial malleolusu kesin ve kemik iliği hücrelerini tibianın her iki ucundan akış tamponu ile yıkayın. 18 gauge iğneli 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri dağıtın.
Tek hücreli süspansiyonu üç dakika boyunca dört santigrat derece ve 400 G'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve RBC'leri üç dakika boyunca lize etmek için hücreleri beş mililitre kırmızı kan hücresi veya RBC, lizis tamponunda yeniden askıya alın. Lizisi durdurmak için beş mililitre akış tamponu ekleyin.
Daha sonra hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve peletleri beş mililitre akış tamponunda yeniden askıya alın. 50 mililitrelik bir tüpe 70 mikronluk bir hücre süzgeci yerleştirin ve hücreleri toplamak için süspansiyonu süzgeçten geçirin. Akış tamponu ile hücre konsantrasyonunu, yuvarlak tabanlı polipropilen tüplerde mililitre başına bir kez 10 ila sekiz arasında ayarlayın.
Üreticinin talimatlarına göre bir fare hematopoetik hücre izolasyon kiti kullanarak soy negatif hücreleri seçin. Bir kez yapıldıktan sonra, sıralanmış hematopoetik kök hücreleri ve sıralanmamış soy-negatif hücreleri santrifüj edin ve retro-redüktan kaplı bir tabakta üç mililitre 2X sitokin, IMDM ortamı ve üç mililitre viral süpernatantta yeniden askıya alın. Çanağı nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatörde 37 santigrat derecede 6 veya 24 saat boyunca inkübe edin.
Transdüksiyondan sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Gerekirse, çanak tabanına bağlı hücreleri toplamak için tripsin kullanın. Supernatant'ı atın ve peleti önceden ısıtılmış PBS'de yeniden askıya alın.
Hücreleri birincil alıcı fareye retro-orbital veya intraperitoneal olarak 27 gauge yarım iğne ile enjekte edin. Fareyi günlük olarak izleyin. Bir ay sonra, bir HEMAVET'teki tam kan sayımını değerlendirerek lökositozu izlemek için retro-orbital kanama ile haftalık kan toplayın.
Gözü başparmak ve işaret parmağıyla proptozlayın, daha sonra venöz sinüs pleksusuna steril bir hematokrit kılcal tüp ile iç kanthustan nüfuz edin. Bir EDTA kan toplama tüpüne 20 ila 25 mikrolitre kan toplayın ve kanamayı durdurmak için göz kapaklarını kapatın. Göze bir damla gentamisin sülfat oftalmik çözeltisi uygulayın.
Beyaz kan hücreleri mikrolitre başına dört kez 10'a ulaştığında, femurları ve tibiaları akış tamponu ile yıkayarak kemik iliği hücrelerini izole edin, ardından daha önce açıklandığı gibi RBC lizisi izleyin. Daha sonra, splenositleri hasat etmek için, fareyi strafor bir tahta üzerindeki steril bir cerrahi pedin üzerine yerleştirin ve bacakları fare pençesi pedlerinden geçirin. Fareyi %70 etanol ile sterilize edin.
Karın boşluğunu keskin uçlu steril makasla ortaya çıkarmak için orta hattaki cildi ve kası kesin. Dalağı izole edin ve 15 mililitrelik bir tüpte bir akış tamponuna koyun. Dalağı, üç mililitre akış tamponuna sahip altı santimetrelik bir tabakta 70 mikronluk bir süzgeçten geçirin.
Hücreleri çanaktan 15 mililitrelik bir tüpe aktarın, ardından tek hücreli süspansiyonu santrifüj edin, süpernatanı atın ve peleti üç dakika boyunca beş mililitre RBC lizis tamponunda yeniden askıya alın. Lizisi durdurmak ve hücre süspansiyonunu santrifüj etmek için beş mililitre akış tamponu ekleyin. Peletleri beş mililitrelik bir akış tamponunda tekrar askıya alın, karıştırın ve hücreleri 50 mililitrelik bir tüpe toplamak için 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin.
Primer akut miyeloid lösemi veya AML hücrelerini, splenositleri ve kemik iliği hücrelerini FITC konjuge anti-fare CD45.1 antikoru ile boyayarak ve bir akış sitometresinde tespit ederek tanımlayın. Hücreler ilk önce FSC-A, FSC-H ve FSC-A SSC-A üzerine kapılıdır. CD45.1 pozitif popülasyonu, FL1 grafiği üzerinde, lekelenmemiş hücrelerle karşılaştırılarak kapılıdır.
Sekonder transplantasyon için, PBS'deki birincil retro-orbital alıcılardan CD45.1 AML splenik hücrelerini yeniden askıya alın ve bunları CD45.2 erkek fareye retro-orbital olarak enjekte edin. Anormal lökositoz varlığı ve kemik iliği ve dalakta lösemik hücrelerin artmış infiltrasyonu, primer AML üretmek için kemik iliği soy-negatif hücrelerin kullanılmasının fizibilitesini desteklemektedir. LSK veya soy-negatif hücrelerle çevrilen primer alıcılarda anlamlı bir fark gözlenmedi.
AML hücreleri, primer alıcıların karın boşluğunda karışık soy lösemisi veya MLL-AF9 transdüe soy-negatif hücreler tarafından yayılır. Bu sonuçlar aynı zamanda lökositoz şeklinde MLL-AF9 transdüe kemik iliği soy-negatif hücrelerinin intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla primer AML'nin oluşumunu ve alıcı farelerin kemik iliği ve dalağında AML hücrelerinin varlığını doğrulamıştır. Bununla birlikte, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla yapılan primer transplantasyonun, eşit sayıda donör hücreye rağmen AML'yi geliştirmesi, retro-orbital enjeksiyondan daha uzun sürdü.
Sekonder alıcılarda transplantasyon sonrası bir aydan kısa bir sürede lökositoz ve belirgin hepatosplenomegali saptandı. AML hücreleri ayrıca periferik kan, kemik iliği ve dalakta ve ayrıca periton boşluğunda tespit edildi. Beş AML hücresine sekiz kez 10 intraperitoneal enjeksiyon, beş AML'ye sekiz kez 10'luk retro-orbital enjeksiyonla karşılaştırılabilir engraftmana ulaştı.
Üçüncül alıcı fareler akut olarak lökositoz ve hepatosplenomegali, kan, kemik iliği ve dalakta lösemik hücrelerin varlığı, femur ve dalağın histolojik gözlemi gibi AML bulguları sergiledi ve lösemik hücrelerin infiltrasyonunu gösterdi. Sekonder ve üçüncül transplantasyonlarla karşılaştırıldığında üçüncül transplantasyon sekonder transplantasyondan çok daha hızlı ilerlemiştir. Geçerli model için LSK hücrelerini sıralamak gereksizdir.
Lin-negatif hücreler AML virüsü ile 6 saat veya 24 saat boyunca dönüştürülebilir. Model kurulumunun verimliliğini etkilemeyecektir.
