이 프로토콜은 동일한 공여자 마우스로부터 분리된 린-음성 세포 및 SK 세포가 MLL-AF9 유도 AML의 생성에 명백한 차이가 없었기 때문에 중요하다. 또한, 백혈병 세포의 IP 주입은 AML의 마우스 모델을 성공적으로 개발할 수 있다. 기존의 이식 방법에 비해이 기술은 더 편리하고 저렴합니다.
시작하려면 8-10 주 된 CD45.1 암컷 C57BL / 6J 마우스를 70 % 에탄올로 멸균하십시오. 스티로폼 보드의 멸균 수술용 패드에 마우스를 놓고 마우스 발 패드를 통해 다리를 고정합니다. 정중선에서 복강 위의 피부를 자르고 날카로운 끝 멸균 가위로 뒷다리쪽으로 피하 공간을 넓힙니다.
복부 정중선에서 발목까지 절개를 확장하고 날카로운 가위로 뒷다리 아래의 피하 공간을 넓힙니다. 날카로운 가위로 아킬레스 건을 자릅니다. 이빨이 있는 집게를 사용하여 힘줄을 잡고 대퇴골에 부착된 다른 쪽 끝을 잘라 비복근을 제거합니다.
날카로운 가위로 무릎에 부착 된 대퇴사 두근 힘줄을 자릅니다. 힘줄을 잡고 대퇴골에 부착된 근육머리를 잘라 비복근을 제거합니다. 경골에 부착된 끝에서 대퇴골을 둘러싼 다른 근육을 절단합니다.
그런 다음 날카로운 가위로 발목을 잘라 경골이 손상되지 않도록합니다. 대퇴골의 말단부를 잡고 날카로운 가위로 고관절을 절단하여 대퇴골두가 손상되지 않도록 합니다. 경골과 대퇴골을 15밀리리터 튜브의 유동 완충액으로 옮깁니다.
손으로 무릎을 부러 뜨려 경골과 대퇴골을 분리하십시오. 슬개골, 연골 및 대퇴골 과두를 제거하여 경골 고원과 원위 대퇴골을 노출시킵니다. 멸균 거즈를 사용하여 근육을 제거하고 뼈를 흐름 완충액에 담그십시오.
대퇴골 경부를 절단하고 23게이지 바늘이 있는 10밀리리터 주사기를 사용하여 대퇴골 양쪽 끝의 흐름 완충액으로 골수 세포를 플러시합니다. 다음으로, 경골 복사뼈를 절단하고 경골의 양쪽 끝에서 유동 완충액으로 골수 세포를 플러시합니다. 18 게이지 바늘이 있는 10밀리리터 주사기를 사용하여 위아래로 피펫팅하여 세포를 분산시킵니다.
단일 세포 현탁액을 섭씨 4도 및 400G에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 5밀리리터의 적혈구 또는 적혈구 용해 완충액에 세포를 재현탁하여 적혈구를 3분 동안 용해시킵니다. 용해를 중지하기 위해 5밀리리터의 유동 버퍼를 추가합니다.
그런 다음 세포 현탁액을 원심분리하고 펠릿을 5밀리리터의 유동 완충액에 재현탁합니다. 70 미크론 셀 스트레이너를 50 밀리리터 튜브에 놓고 현탁액을 스트레이너를 통해 통과시켜 세포를 수집합니다. 유동 완충액으로 세포 농도를 둥근 바닥 폴리프로필렌 튜브에서 밀리리터당 10 내지 8배로 조정합니다.
제조업체의 지침에 따라 마우스 조혈 세포 분리 키트를 사용하여 계통 음성 세포를 선택합니다. 완료되면 분류된 조혈 줄기 세포와 분류되지 않은 계통 음성 세포를 원심분리하고 역환원제 코팅 접시에 2X의 사이토카인, IMDM 배지 및 바이러스 상청액 3밀리리터 3밀리리터에 재현탁합니다. 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 6시간 또는 24시간 동안 접시를 배양합니다.
형질도입 후, 원심분리에 의해 세포를 수확한다. 필요한 경우 트립신을 사용하여 접시 바닥에 부착된 세포를 수집합니다. 상청액을 버리고 예열된 PBS에 펠릿을 재현탁합니다.
27 게이지 하프 니들을 사용하여 1차 수용자 마우스에 역궤도 또는 복강내 세포를 주입합니다. 매일 마우스를 모니터링하십시오. 1개월 후, HEMAVET의 전체 혈구 수를 평가하여 백혈구 증가증을 모니터링하기 위해 안와후 출혈로 매주 혈액을 수집합니다.
엄지와 검지로 눈을 돌출시킨 다음 내부 안각을 통해 멸균 된 헤마토크릿 모세 혈관으로 정맥동 신경총을 관통합니다. EDTA 혈액 수집 튜브에 20-25 마이크로 리터의 혈액을 모으고 눈꺼풀을 닫아 출혈을 멈 춥니 다. gentamycin sulfate 점과 용액 한 방울을 눈에 바릅니다.
백혈구가 마이크로리터당 4배 10 내지 4개의 세포에 도달하면, 대퇴골 및 경골을 유동 완충액으로 플러싱하여 골수 세포를 분리하고, 앞서 기술한 바와 같이 RBC 용해를 수행한다. 다음으로, 비장 세포를 채취하기 위해 마우스를 스티로폼 보드의 멸균 수술 패드에 놓고 마우스 발 패드를 통해 다리를 고정합니다. 마우스를 70 % 에탄올로 소독하십시오.
정중선에서 피부와 근육을 잘라 뾰족한 멸균 가위로 복강을 노출시킵니다. 비장을 분리하고 15 밀리리터 튜브의 흐름 완충액에 넣습니다. 3 밀리리터의 유동 완충액이있는 6 센티미터 접시에 70 미크론 여과기를 통해 비장을 메쉬합니다.
세포를 접시에서 15 밀리리터 튜브로 옮긴 다음, 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고, 상청액을 버리고, 펠렛을 5 밀리리터의 RBC 용해 완충액에 3 분 동안 재현탁시킨다. 5 밀리리터의 유동 완충액을 첨가하여 용해를 중지하고 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 펠릿을 5 밀리리터의 유동 완충액에 재현 탁하고, 혼합하고 70 미크론 셀 스트레이너를 통과시켜 세포를 50 밀리리터 튜브에 수집한다.
원발성 급성 골수성 백혈병 또는 AML 세포를 FITC 접합 항-마우스 CD45.1 항체로 염색하고 유세포 분석기 상에서 검출하여 세포를 확인한다. 세포는 먼저 FSC-A, FSC-H 및 FSC-A SSC-A에서 게이트되어 단일항을 획득합니다. CD45.1 양성 집단은 염색되지 않은 세포와 비교하여 FL1 플롯에서 게이팅됩니다.
2차 이식의 경우, PBS에서 1차 역안와 수용자로부터 CD45.1 AML 비장 세포를 재현탁하고 CD45.2 수컷 마우스에 역안와로 주사합니다. 비정상적인 백혈구 증가증의 존재와 골수 및 비장에서 백혈병 세포의 침윤 증가는 골수 계통 음성 세포를 사용하여 원발성 AML을 생성할 수 있는 가능성을 뒷받침합니다. LSK 또는 계통 음성 세포로 번역된 1차 수혜자에서는 유의미한 차이가 관찰되지 않았습니다.
AML 세포는 혼합 계통 백혈병 또는 MLL-AF9 형질도입된 계통 음성 세포에 의해 1차 수혜자의 복강 내에서 퍼집니다. 이러한 결과는 또한 백혈구 증가증의 형태로 형질도입된 골수 계통 음성 세포의 복강내 주사를 통해 원발성 AML의 확립과 수용자 마우스의 골수 및 비장에서 AML 세포의 존재를 확인했습니다. 그러나 복강내 주사를 통한 1차 이식은 동일한 수의 기증자 세포에도 불구하고 안와 후 주사를 통한 것보다 AML이 발생하는 데 더 오래 걸렸습니다.
2차 수혜자는 이식 후 1개월 이내에 백혈구 증가증과 상당한 간비종대를 보였습니다. AML 세포는 복강뿐만 아니라 말초 혈액, 골수 및 비장에서도 검출되었습니다. 5개의 AML 세포에 8배의 10배의 복강내 주사는 5개의 AML에 8배의 10배의 후안와주사에 필적하는 생착을 달성하였다.
3차 수용자 마우스는 백혈구 증가증 및 간비종대를 포함하는 AML 징후를 급성으로 나타내었고, 혈액, 골수 및 비장에 백혈병 세포의 존재를 나타냈으며, 대퇴골 및 비장의 조직학적 관찰은 백혈병 세포의 침윤을 추가로 입증했습니다. 2차 및 3차 이식에 비해 3차 이식은 2차 이식보다 훨씬 빠르게 진행되었습니다. 현재 모델의 경우 LSK 셀을 정렬할 필요가 없습니다.
Lin-음성 세포는 6시간 또는 24시간 동안 AML 바이러스로 형질도입될 수 있습니다. 모델 설정의 효율성에는 영향을 미치지 않습니다.
