Этот протокол важен, потому что lin-отрицательные клетки и клетки SK, выделенные от одних и тех же мышей-доноров, не имели видимых различий в генерации MLL-AF9, индуцированного AML. Кроме того, IP-инъекция лейкозных клеток может успешно разработать мышиную модель ОМЛ. По сравнению с обычными методами трансплантации, эта методика более удобна и менее затратна.
Для начала стерилизуйте мышь C57BL/6J женского пола CD45.1 в возрасте от 8 до 10 недель 70% этанолом. Поместите мышь на стерильную хирургическую подушечку на доске из пенополистирола и прижмите ноги к подушечкам лап мыши. Разрежьте кожу над брюшной полостью по средней линии и расширьте подкожное пространство к задним лапам стерильными ножницами с острым концом.
Расширьте разрез от средней линии живота вниз до лодыжек и расширьте подкожное пространство ниже задних лап лезвиями ножниц с острым концом. Разрежьте ахиллово сухожилие ножницами с острым концом. Возьмитесь за сухожилие с помощью щипцов с зубами и отрежьте другой конец, прикрепленный к бедренной кости, чтобы удалить икроножную мышцу.
Разрежьте сухожилие четырехглавой мышцы, прикрепленное к колену, ножницами с острым концом. Возьмитесь за сухожилие и разрежьте головку мышцы, прикрепленную к бедренной кости, чтобы удалить икроножную мышцу. Разрежьте другие мышцы, окружающие бедренную кость на конце, прикрепленном к большеберцовой кости.
Затем разрежьте лодыжку ножницами с острым концом, следя за тем, чтобы большеберцовая кость оставалась целой. Возьмитесь за дистальный конец бедренной кости и разрежьте тазобедренный сустав ножницами с острым концом, следя за тем, чтобы головка бедренной кости оставалась неповрежденной. Перенесите большеберцовую кость и бедренную кость в буфер потока в 15-миллилитровой пробирке.
Разделите большеберцовую и бедренную кости, сломав колено рукой. Удалите надколенник, хрящи и мыщелки бедренной кости, чтобы обнажить плато большеберцовой кости и дистальный отдел бедренной кости. Удалите мышцы с помощью стерильной марли и замочите кости в буфере потока.
Разрежьте шейку бедренной кости и промойте клетки костного мозга буфером потока с обоих концов бедренной кости с помощью шприца объемом 10 миллилитров с иглой 23 калибра. Затем разрежьте лодыжку большеберцовой кости и промойте клетки костного мозга буфером потока с обоих концов большеберцовой кости. Диспергируйте клетки, пипеткой вверх и вниз с помощью 10-миллилитрового шприца с иглой 18-го калибра.
Центрифугируйте одноячеистую суспензию при четырех градусах Цельсия и 400 G в течение трех минут. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в пяти миллилитрах эритроцитов или эритроцитов, буфера для лизиса эритроцитов в течение трех минут. Добавьте пять миллилитров буфера потока, чтобы остановить лизис.
Затем центрифугируют клеточную суспензию и ресуспендируют гранулу в пяти миллилитрах проточного буфера. Поместите 70-микронный клеточный фильтр на 50-миллилитровую пробирку и пропустите суспензию через сетчатый фильтр для сбора клеток. Отрегулируйте концентрацию ячеек с буфером потока до 10 раз до восьми на миллилитр в полипропиленовых пробирках с круглым дном.
Выберите клетки с отрицательным происхождением, используя набор для выделения гемопоэтических клеток мыши в соответствии с инструкциями производителя. После этого центрифугируют отсортированные гемопоэтические стволовые клетки и несортированные клетки с отрицательной линией и ресуспендируют в трех миллилитрах 2X цитокинов, сред IMDM и трех миллилитров вирусной надосадочной жидкости в чашке, покрытой ретро-восстановителем. Инкубируйте блюдо в увлажненном 5%-ном инкубаторе с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия в течение 6 или 24 часов.
После трансдукции собирают клетки центрифугированием. При необходимости используйте трипсин для сбора клеток, прикрепленных к дну чашки. Выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулы в предварительно разогретом PBS.
Вводите клетки в мышь-реципиента ретроорбитально или внутрибрюшинно с помощью полуиглы 27-го калибра. Ежедневно следите за мышью. Через месяц еженедельно собирайте кровь с помощью ретроорбитального кровотечения для мониторинга лейкоцитоза путем оценки общего анализа крови на ГЕМАВЕТ.
Проптоузируйте глаз большим и указательным пальцами, затем проникните в венозное синусовое сплетение стерильной гематокритной капиллярной трубкой через внутренний кантус. Соберите от 20 до 25 микролитров крови в пробирку для сбора крови ЭДТА и закройте веки, чтобы остановить кровотечение. Нанесите одну каплю офтальмологического раствора гентамицина сульфата на глаз.
Когда лейкоциты достигают четырех раз от 10 до четырех клеток на микролитр, изолируют клетки костного мозга, промывая бедренные кости и большеберцовые кости буфером потока с последующим лизисом эритроцитов, как описано ранее. Затем, чтобы собрать спленоциты, поместите мышь на стерильную хирургическую подушечку на доске из пенополистирола и закрепите ноги через подушечки лап мыши. Стерилизуйте мышь 70% этанолом.
Разрежьте кожу и мышцы по средней линии, чтобы обнажить брюшную полость стерильными ножницами с острым концом. Изолируйте селезенку и поместите ее в проточный буфер в 15-миллилитровой пробирке. Пропустите селезенку через 70-микронное ситечко в шестисантиметровой чашке с тремя миллилитрами буфера потока.
Перенесите клетки из чашки в 15-миллилитровую пробирку, затем центрифугируйте одноклеточную суспензию, выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в пяти миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов в течение трех минут. Добавьте пять миллилитров буфера потока, чтобы остановить лизис, и центрифугируйте клеточную суспензию. Ресуспендируйте гранулу в пяти миллилитрах проточного буфера, перемешайте и пропустите через 70-микронный сетчатый фильтр, чтобы собрать ячейки в 50-миллилитровую пробирку.
Идентификация клеток первичного острого миелоидного лейкоза или ОМЛ путем окрашивания спленоцитов и клеток костного мозга конъюгированным антителом FITC против мыши CD45.1 и обнаружения на проточном цитометре. Клетки сначала закрываются на FSC-A, FSC-H и FSC-A SSC-A для получения синглетов. CD45.1-положительная популяция закрывается на графике FL1 путем сравнения его с неокрашенными клетками.
Для вторичной трансплантации ресуспендируют клетки селезенки CD45.1 AML от первичных реципиентов ретроорбитальной области в PBS и вводят их ретроорбитально мышам-самцам CD45.2. Наличие аберрантного лейкоцитоза и повышенной инфильтрации лейкозных клеток в костном мозге и селезенке подтверждает возможность использования отрицательных клеток линии костного мозга для генерации первичного ОМЛ. Не наблюдалось существенных различий у первичных реципиентов, транслируемых с помощью LSK или клеток с отрицательной линией.
Клетки ОМЛ распространяются в брюшной полости первичных реципиентов лейкозом смешанной линии или клетками, трансдуцированными MLL-AF9. Эти результаты также подтвердили установление первичного ОМЛ посредством внутрибрюшинной инъекции трансдуцированных MLL-AF9 клеток костного мозга, отрицательных по линии костного мозга в форме лейкоцитоза и присутствия клеток AML в костном мозге и селезенке мышей-реципиентов. Однако первичная трансплантация с помощью внутрибрюшинной инъекции заняла больше времени для развития ОМЛ, чем с помощью ретроорбитальной инъекции, несмотря на равное количество донорских клеток.
Вторичные реципиенты показали лейкоцитоз и значительную гепатоспленомегалию менее чем через месяц после трансплантации. Клетки ОМЛ также были обнаружены в периферической крови, костном мозге и селезенке, а также в брюшной полости. Внутрибрюшинная инъекция восьми раз по 10 пяти клеткам ОМЛ достигала сопоставимого приживления с ретроорбитальной инъекцией в восемь раз по 10 к пяти ОМЛ.
У мышей-реципиентов третичного уровня остро проявлялись признаки ОМЛ, включая лейкоцитоз и гепатоспленомегалию, наличие лейкозных клеток в крови, костном мозге и селезенке, гистологическое наблюдение бедренной кости и селезенки дополнительно продемонстрировало инфильтрацию лейкозных клеток. По сравнению с вторичной и третичной трансплантацией, третичная трансплантация прогрессировала намного быстрее, чем вторичная трансплантация. Для текущей модели сортировка ячеек LSK не нужна.
Lin-отрицательные клетки могут быть трансдуцированы вирусом AML в течение 6 часов или 24 часов. Это не повлияет на эффективность создания модели.
