该方案很重要，因为从同一供体小鼠分离的lin阴性细胞和SK细胞在MLL-AF9诱导的AML的产生中没有明显的差异。此外，白血病细胞的IP注射可以成功开发AML的小鼠模型。与传统的移植方法相比，这种技术更方便，更便宜。
首先，用8%乙醇对8至10周龄的CD45.1雌性C57BL / 6J小鼠进行灭菌。将鼠标放在泡沫塑料板上的无菌手术垫上，然后将腿穿过鼠标爪垫。在中线切开腹腔上方的皮肤，并用锋利的无菌剪刀将皮下空间扩大到后腿。
将切口从腹部中线向下延伸到脚踝，并用锋利的剪刀刀片扩大后腿下方的皮下空间。用锋利的剪刀剪断跟腱。用带齿的镊子握住肌腱，切开附着在股骨上的另一端以去除腓肠肌。
用锋利的剪刀剪断附着在膝盖上的股四头肌肌腱。握住肌腱并切开附着在股骨上的肌肉头以去除腓肠肌。切断连接到胫骨末端的股骨周围的其他肌肉。
接下来，用锋利的剪刀剪断脚踝，确保胫骨保持完整。握住股骨远端，用锋利的剪刀剪断髋关节，确保股骨头保持完整。将胫骨和股骨转移到 15 毫升管中的流动缓冲液中。
用手打破膝盖来分开胫骨和股骨。切除髌骨、软骨和股骨髁，露出胫骨平台和股骨远端。使用无菌纱布去除肌肉，并将骨骼浸泡在流动缓冲液中。
切开股骨颈，并使用带有23号针头的10毫升注射器从股骨两端用流动缓冲液冲洗骨髓细胞。接下来，切开胫踝并用来自胫骨两端的流动缓冲液冲洗骨髓细胞。通过使用带有18号针头的10毫升注射器上下移液来分散细胞。
将单细胞悬液在4摄氏度和400G下离心三分钟。弃去上清液并将细胞重悬于五毫升红细胞或红细胞裂解缓冲液中以裂解红细胞三分钟。加入五毫升流动缓冲液以停止裂解。
然后离心细胞悬液并将沉淀重悬于五毫升流动缓冲液中。将70微米的细胞过滤器放在50毫升的管上，并将悬浮液通过过滤器以收集细胞。在圆底聚丙烯管中，用流动缓冲液将细胞浓度调节至每毫升10至8倍。
根据制造商的说明，使用小鼠造血细胞分离试剂盒选择谱系阴性细胞。完成后，离心分选的造血干细胞和未分选的谱系阴性细胞，并在反还原剂包衣的培养皿中重悬于三毫升 2X 细胞因子、IMDM 培养基和三毫升病毒上清液中。将培养皿在 37 摄氏度的加湿 5% 二氧化碳培养箱中孵育 6 或 24 小时。
转导后，通过离心收获细胞。如果需要，使用胰蛋白酶收集附着在培养皿底部的细胞。弃去上清液并将沉淀重悬于预热的PBS中。
用27号半针将细胞眶后或腹膜内注射到主要受体小鼠中。每天监控鼠标。一个月后，每周通过眶后出血采集血液，通过评估 HEMAVET 的全血细胞计数来监测白细胞增多。
用拇指和食指撑起眼睛，然后用无菌血细胞比容毛细管穿过内眦穿透静脉窦丛。将20至25微升血液收集到EDTA采血管中并关闭眼睑以止血。将一滴硫酸庆大霉素眼用溶液涂抹在眼睛上。
当白细胞达到每微升 10 到 4 个细胞的四倍时，通过用流动缓冲液冲洗股骨和胫骨来分离骨髓细胞，然后如前所述进行红细胞裂解。接下来，为了收获脾细胞，将鼠标放在泡沫塑料板上的无菌手术垫上，并将腿穿过鼠标爪垫。用70%乙醇对小鼠进行消毒。
用锋利的无菌剪刀切开中线的皮肤和肌肉，露出腹腔。分离脾脏并将其放入15毫升管中的流动缓冲液中。在装有三毫升流动缓冲液的 6 厘米培养皿中通过 70 微米过滤器将脾脏啮合。
将细胞从培养皿转移到15毫升管中，然后离心单细胞悬液，弃去上清液，并将沉淀重悬于5毫升红细胞裂解缓冲液中3分钟。加入五毫升流动缓冲液以停止裂解并离心细胞悬液。将沉淀重悬于5毫升流动缓冲液中，混合并通过70微米细胞过滤器，将细胞收集到50毫升管中。
通过用FITC偶联的抗小鼠CD45.1抗体染色脾细胞和骨髓细胞并在流式细胞仪上进行检测来鉴定原发性急性髓系白血病或AML细胞。首先在FSC-A FSC-H和FSC-A SSC-A上对细胞进行门控以获得单线态。通过将其与未染色的细胞进行比较，在 FL1 图上对 CD45.1 阳性群体进行门控。
对于二次移植，将来自PBS中主要眶后受者的CD45.1 AML脾细胞重悬，并将其眶后注射到CD45.2雄性小鼠中。骨髓和脾脏中白细胞增多和白血病细胞浸润增加的存在支持了使用骨髓谱系阴性细胞产生原发性 AML 的可行性。在用LSK或谱系阴性细胞翻译的主要受者中没有观察到显着差异。
AML细胞通过混合谱系白血病或MLL-AF9转导谱系阴性细胞在主要受体的腹腔中扩散。这些结果还证实了通过腹膜内注射白细胞增多形式的MLL-AF9转导骨髓谱系阴性细胞以及受体小鼠骨髓和脾脏中AML细胞的存在来建立原发性AML。然而，尽管供体细胞数量相同，但通过腹膜内注射进行初次移植比通过眶后注射需要更长的时间才能产生AML。
次要受者在移植后不到一个月内表现出白细胞增多和明显的肝脾肿大。在外周血、骨髓和脾脏以及腹膜腔中也检测到AML细胞。腹膜内注射8乘以10到5个AML细胞，实现了与8乘以10到5个AML的眶后注射相当的植入。
三级受体小鼠急性表现出AML体征，包括白细胞增多和肝脾肿大，血液，骨髓和脾脏中存在白血病细胞，股骨和脾脏的组织学观察进一步证明了白血病细胞的浸润。与二级和三级移植相比，三级移植的进展比二次移植快得多。对于当前模型，不需要对 LSK 单元格进行排序。
林阴性细胞可以用AML病毒转导6小时或24小时。它不会影响模型建立的效率。
